High-throughput capillary-flow LC-MS proteomics with maximum MS utilization

Význam tématu

V moderní proteomice roste potřeba rychlých a citlivých LC-MS metod, které zvládnou stovky vzorků denně. Konvenční nanoLC se sice vyznačuje vysokým rozlišením, ale dlouhými gradienty a výrazným prostoji pro mytí a ekvilibraci kolony omezuje propustnost. Tento přístup omezuje aplikace v klinickém výzkumu, QA/QC i v potravinářské analýze, kde se vyžaduje vysoká vzorkovací frekvence a nízká spotřeba vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují high-throughput kapilární LC-MS protokol s využitím standardní platformy UltiMate 3000 RSLCnano. Cílem bylo zkrátit dobu jedné analýzy na 8 minut při zachování vysokého rozlišení a citlivosti a s maximalizací využití hmotnostního spektrometru (MS-utilization) na 75 %.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje online předkoncentraci na trapu, rychlou eluci gradientem 8–35 % ACN/0,1 % FA a automatizované mytí injektoru mezi analýzami. Klíčové parametry:

• Kapilární kolona 15 cm × 75 µm, 3 µm částice (EASY-Spray ES800)
• Flow rate gradientu 1,5 µl/min, loading 150 µl/min (6 s transfer fragmentu)
• Automatizované mytí injektoru 25 µl 100 % ACN/0,1 % FA
• Eluce v rozmezí 0–6,8 min, mytí a ekvilibrace 6,8–8,0 min

Použitá instrumentace

• UltiMate 3000 RSLCnano
• ProFlow průtokoměr
• Thermo Scientific Q Exactive™ HF-X
• EASY-Spray™ ES800 kapilární kolony a nanoViper™ spojky
• Xcalibur™, Chromeleon™ CDS a Proteome Discoverer™ 2.2

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožňuje 180 analýz denně, přičemž 6 minut z 8 min pipelinu představuje aktivní měření peptidů. Retenční časy vybraných druhů HeLa peptidů mají standardní odchylku < 0,1 min, variability ploch pod 10 % a šířky FWHM < 3 s. Při DDA režimu (TOP40, 14 ms IT) generuje Q Exactive HF-X > 10 000 MS/MS dat za vzorek a identifikuje ~ 6200 PSMs z 200 ng digestu. Metrics carryover pod < 0,2 %.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá výměna vzorků a vysoké MS-využití umožňuje aplikaci v biomarker screeningových studiích, populaci proteomiky, QA/QC v biobankách i potravinářské kontrole. Nízký průtok minimalizuje spotřebu vzorku a rozpouštědel, přičemž systém zůstává kompatibilní s hlubokou nanoLC a mikro-flow metodami.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj hybridních přístupů kombinujících ultrarychlou kapilární separaci s ion‐mobility nebo paralelním MS/MS. Dále se otevírají aplikace v klinické rutinní diagnostice a integraci s pokročilou datovou analýzou pomocí strojového učení.

Závěr

Popsaná high-throughput kapilární metoda dosahuje jedinečného poměru rychlosti, citlivosti a propustnosti, aniž by bylo nutné měnit základní hardware nano-LC-MS platformy. Umožňuje kontinuální analýzu stovek vzorků denně s vysokou reprodukovatelností a minimálním carryover.

Reference

1. Meding S., Boychenko A. Capillary Flow LC-MS Unites Sensitivity and Throughput. Chromatography Today. 2016;43–45.
2. Steinhilber A.E. et al. Mass Spectrometry-Based Ruminant Processed Animal Proteins in Vegetal Feeds. Anal. Chem. 2018;90(6):4135–4143.
3. Boychenko A. et al. Sensitive, Fast and Robust Quantification of Antibodies in Complex Matrices by Capillary Flow UHPLC and High-Resolution Accurate-mass MS. PN-64787.
4. Thermo Fisher Scientific. UltiMate 3000 RSLCnano System – Versatility and Performance. BR-71898. 2016.
5. Thermo Fisher Scientific. Comprehensive and versatile low-flow UHPLC system for routine and advanced LC-MS applications. PS-71899.