Abundant Protein Depletion of Human Plasma Samples – A Reproducibility and Scaling Study

Význam tématu

Deplece vysoce abundantních proteinů z lidské plazmy je klíčovým krokem při identifikační a kvantitativní analýze nízkomolekulárních biomarkerů. Velký dynamický rozsah koncentrací proteinů v plazmě omezuje citlivost a rozsah LC-MS analýz. Efektivní a reprodukovatelná odstranění nejhojnějších složek umožňuje detekovat vzácné proteiny, které mohou nést diagnostické či prognostické informace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a charakterizovat dvě nové imunoaffinitní pryskyřice (Top2 pro odstranění albuminu a IgG a Top12 pro širší panel 12 abundantních proteinů) ve formě jednorázových spin‐sloupců. Studie hodnotila:

• Efektivitu deplece (>95 % cílových proteinů)
• Rozsah vzorkových množství (10 µl vs. 100 µl plazmy)
• Reprodukovatelnost jak v biologických, tak v analytických replikátech
• Efekt na počet identifikovaných a kvantifikovaných proteinů

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky komerčně získané normální lidské plazmy byly ošetřeny spin‐sloupci Top2 a Top12 při optimalizovaných bind-wash-elute podmínkách. Dopo deplece proběhlo:

• Snížení a alkylace proteinů (TCEP, CAA, 95 ºC)
• Presipitace methanolem a rozpuštění ve HEPES
• Trypsinová digesce (1:50, 16 h, 40 °C)
• Desalting a měření peptide recoveries (Thermo Pierce).

Analytická měření:

• LC-MS/MS na Orbitrap Fusion Tribrid s Dionex Ultimate 3000 Nano LC
• Data processing v Proteome Discoverer 1.4 a Skyline 3.6
• Proteinová kvantifikace: BCA assay
• Peptidová kvantifikace: Quantitative Colorimetric Peptide Assay

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky prokázaly >95 % účinnost deplece všech cílových proteinů u obou pryskyřic s velmi nízkými CV (<1 % u MS kvantifikace, <30 % celkové recovery). Po depleci Top2 a Top12 došlo ke zvýšení počtu identifikovaných proteinových skupin až o 10 % respektive 30 %. Srovnání deplece měřené ELISA a MS-založenými peptidovými assay poskytlo konzistentní výsledky. Reprodukovatelnost recovery nevazebních proteinů byla rovněž vysoká, což dokazuje robustnost postupu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Jednoduché jednorázové sloupce vhodné pro rutinní QA/QC i výzkum.
• Možnost automatizace pro vysokopropustné laboratoře.
• Rozšíření proteomického pokrytí vzácných plazmatických proteinů.
• Kompatibilitu s běžnými workflow LC-MS a bioinformatickými nástroji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj multifunkčních affinitních materiálů cílených na vzácné proteiny, integrace depletion modulů přímo v LC rozhraní a rozšíření o netypické proteinové biomarkery. Kombinace s kvantitativními metodami (SWATH-MS, Izobarické značení) může dále zvýšit citlivost.

Závěr

Vyvinuté Top2 a Top12 pryskyřice pro depleci abundantních proteinů z lidské plazmy prokázaly vysokou účinnost, výbornou reprodukovatelnost a významně rozšířily proteomické pokrytí. Metoda představuje robustní nástroj pro biomarker discovery i rutinní analytická využití.

Reference