Relative quantification using TMT11plex on a modified Q Exactive HF mass spectrometer

Význam tématu

Rychlá a přesná relativní kvantifikace proteinů je klíčová pro pochopení biologických procesů a identifikaci rozdílů v expresi proteinů při různých experimentálních podmínkách. Použití isobarických TMT štítků v kombinaci s vysoce výkonnou hmotnostní spektrometrií umožňuje paralelní analýzu až 11 vzorků, což významně zvyšuje průtok a spolehlivost dat v proteomických studiích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon nové hybridní kvadrupól-Orbitrap™ hmotové spektrometrie Q Exactive HF-X s předchozím modelem Q Exactive HF při relativní kvantifikaci pomocí TMT11plex. Autoři testovali identifikaci a kvantifikaci peptidů a proteinových skupin, rychlost akvizice a citlivost na různých nastaveních rozlišení a šířky izolace iontů.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém kapalné chromatografie: Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1200 s kolonkou PepMap™ C18 (75 µm × 25 cm, 2 µm, 100 Å) a gradientem 6–32 % ACN/FA během 85 min.
• Izobarické značení: Thermo Scientific™ TMT11plex reagenty, směs ve stechiometrických poměrech 11 kanálů.
• Hmotové spektrometry: Q Exactive HF a Q Exactive HF-X v datově řízeném módu (DDA), top20 fragmentace.
• Nastavení MS: rozlišení 120 000 @ m/z 200, rozsah 350–1 400 m/z, AGC 3e6, max. inj. čas 50 ms.
• Nastavení MS/MS: rozlišení 45 000 a 60 000 @ m/z 200, AGC 1e5, inj. čas 86–120 ms, izolace 0,7–1,2 Da, kolizní energie HCD 32.
• Analýza dat: Proteome Discoverer 2.1 s vyhledávacím motorem SEQUEST HT, FDR nastaven na 1 %, filtrace unikátních peptidů s S/N > 10, izotopická korekce.

Hlavní výsledky a diskuse

• Na Q Exactive HF-X bylo identifikováno a kvantifikováno až o 18 % více peptidů a 11 % více proteinových skupin ve srovnání s Q Exactive HF.
• Při rozlišení 45 000 dosahuje HF-X rychlosti skenování až ~10 Hz, což je o 25 % více než ~7 Hz při 60 000 na HF.
• Snížení rozlišení MS/MS neovlivňuje baseline rozlišení TMT kanálů a zvyšuje počet skenů za jednotku času.
• Jasnější iontový zdroj a elektronodynamický iontový trychtýř umožňují užší izolaci (0,7 Da) bez ztráty kvantitativní přesnosti.
• V testu ředěných vzorků (10–1 000 ng) HF-X vykázal vyšší citlivost a reprodukovatelnost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená hloubka pokrytí proteomu díky vyšší citlivosti a rychlosti akvizice.
• Efektivní analýza posttranslačních modifikací (PTM) při nižších režimech rozlišení.
• Využití v klinické, farmaceutické a průmyslové proteomice vyžadující vysokou propustnost a kvalitu dat.
• Snížení množství potřebného vzorku pro analýzu vzácných nebo drahých materiálů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření multiplexace nad 11plex pro komplexnější biologické studie.
• Integrace s pokročilými bioinformatickými nástroji, strojovým učením a AI pro hlubší interpretaci proteomických dat.
• Automatizované high‐throughput platformy pro klinickou diagnostiku a farmakovigilanci.
• Aplikace v metaproteomice, toxikoproteomice a vývoji nových terapeutik.

Závěr

Nový Q Exactive HF-X prokázal výrazné zlepšení citlivosti, rychlosti a kvality relativní kvantifikace pomocí TMT11plex oproti svému předchůdci. Nízké rozlišení MS/MS umožňuje vyšší akviziční frekvenci bez kompromisu v rozlišení izobarických štítků, což zvyšuje propustnost a spolehlivost analýzy.

Reference

• Navin Rauniyar, John R. Yates III, J. Proteome Res., 2014, 13(12), 5293–5309.
• Käll L., Canterbury J., Weston J., Noble W.S., MacCoss M., Nature Methods, 2007, 4, 923–925.
• Viner R., Bomgarden R., Blank M., Rogers J., Increasing the Multiplexing of Protein Quantitation from 6 to 10-Plex with Reporter Ion Isotopologues.
• Arrey T.N., Jiang X., Damoc E., Viner R., Xuan Y., Zeller M., Scigelova M., Moehring T., Kellmann M., Isobaric Mass Tagging Quantification Using Q Exactive Instruments.