TMT Workflow on the Q Exactive Series -Instrument Parameter Optimization and Data Analysis in Proteome Discoverer 2.1 Software

Význam tématu

Multiplexní izobarické označování TMT umožňuje relativní kvantifikaci až deseti vzorků v jedné analýze. Snížením variability a zvýšením průtoku vzorků je metoda klíčová pro komplexní proteomické studie, QA/QC laboratoře i biomarkerové aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo optimalizovat akviziční parametry na hmotnostních spektrometrech Thermo Scientific Q Exactive Plus a Q Exactive HF pro relativní kvantifikaci bílkovin pomocí TMTsixplex a TMT10plex, včetně vzorové přípravy, chromatografie, nastavení instrumentu a zpracování dat v Proteome Discoverer 2.1.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: E. coli a HeLa trávicí standardy, označeny TMTsixplex/TMT10plex dle protokolu (TEAB pufr, acetonitril, hydroxylamin).
• Kapalinová chromatografie: Thermo EASY-nLC 1000, trap kolona Acclaim PepMap C18 (75 µm×2 cm), analytická EASY-Spray C18 (75 µm×50 cm), gradient 7–25 % B/100 min, 25–60 % B/20 min.
• Hmotnostní spektrometrie: Q Exactive Plus (MS1 70 000, MS2 30 000–35 000), Q Exactive HF (MS1 120 000, MS2 35 000–60 000), AGC MS1 3e6, AGC MS2 1e5, MS2 IT 50–100 ms, izolace 0,7–1,2 Th, NCE 32, data-dependent acquisition.
• Softwarové zpracování: Proteome Discoverer 2.1 s vlastním workflow, definice kvantifikační metody, import FASTA, nastavení Study Factors, konsenzuální workflow, korekce izotopických distribucí a normalizace S/N.

Hlavní výsledky a diskuse

• Délka gradientu a objem injekce příznivě ovlivnily počet identifikovaných a kvantifikovaných peptidů: 4hodinový gradient a 2 µg vzorku přinesly až 85 % kvantifikovatelných peptidů.
• Pro TMTsixplex postačuje MS2 rozlišení 30 000; pro TMT10plex jsou doporučována rozlišení 35 000 (Q Exactive Plus) a 60 000 (Q Exactive HF) pro rozlišení izotopologů.
• Parametry AGC MS2 1e5 a max. injekční čas 100 ms optimalizují citlivost i kvantitativní přesnost bez výrazných ztrát průchodnosti.
• NCE 32 poskytuje lepší uvolňování reporter iontů při zachování identifikace.
• Užší šířka izolace 0,7 Th minimalizuje koizolační interferenci; na komplexních vzorcích se doporučuje SPS MS3 nebo prefrakcionace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou, multiplexní relativní kvantifikaci bílkovin s vysokou přesností a reprodukovatelností, vhodná pro laboratorní rutinu, farmaceutický výzkum, biomarkerové studie či průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na Ultra-High Field Orbitrap pro vyšší rychlost a rozlišení.
• Implementace SPS MS3 na nových Tribrid spektrometrech pro další snížení interference.
• Vyšší multiplexní kapacity (TMTpro) a automatizace workflow.
• Integrace s bioinformatickými nástroji pro hlubší proteomové pokrytí.

Závěr

Optimalizace parametrů a workflow v Proteome Discoverer 2.1 pro řadu Q Exactive zajišťuje vysokou citlivost, přesnost a spolehlivost TMT-kvantifikace až deseti vzorků v jednom běhu.

Reference

• 1. Schäfer T. et al. Anal Chem. 2003;75(8):1895.
• 2. Ross P. et al. Mol Cell Proteomics. 2004;3(12):1154.
• 3. Savitski M. et al. Science. 2014;346(6205):1255784.
• 4. Weekes M. et al. Cell. 2014;157(6):1460.
• 5. Rauniyar N. et al. J Proteome Res. 2014;13(12):5293.
• 6. Christoforou A. et al. Anal Bioanal Chem. 2012;404(4):1029.
• 7. Erickson B. et al. Anal Chem. 2015;87(2):1241.
• 8. Ting L. et al. Nat Methods. 2011;8:937.
• 9. Scheltema R. et al. Mol Cell Proteomics. 2014;13(12):3698.
• 10. McAlister G. et al. Anal Chem. 2012;84(17):7469.
• 11. Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.1 User Guide.
• 12. Viner R. et al. Thermo Fisher Scientific Application Note 566.
• 13. Werner T. et al. Anal Chem. 2014;86(7):3594.
• 14. Arrey T. et al. Thermo Scientific Poster Note 64412.