MicroLC-MRM Workflow for Cyclic Peptide Quantitation in Human Plasma

Význam tématu

V bioterapeutickém výzkumu a vývoji je klíčové detekovat a kvantifikovat peptidová léčiva v komplexních biologických vzorcích s co nejvyšší citlivostí a selektivitou. Nižší dávky léčiv a omezené objemy vzorků vyžadují metody, které maximalizují ionizační účinnost a omezují interferenci od matrice. Kombinace mikroprůtokové chromatografie (microLC) a vysoce přesné hmotnostní spektrometrie (HRAMS) představuje pokročilý přístup k bioanalýze velkých molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit workflow microLC-MRMHR pro kvantifikaci cyklického peptidu desmopressinu v lidské plasmě. Práce využívá systém SCIEX TripleTOF® 6600+ se zdrojem OptiFlow™ Turbo V a mikroLC systémem M5, srovnává výkon mikroprůtoku a standardního analytického průtoku a stanovuje limity detekce a kvantifikace.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Proteiny sráženy a extrahovány pomocí karboxylových iontoměničových cartridgí WCX.
• Interní standard desmopressin-D5 (100 ng/mL) přidaný do vzorků.
• Eluce 5 % kyseliny octové v methanolu, vysušení a rekonsitituce v kyselině octové.

Chromatografie microflow (M5 microLC):

• Trap-elute režim s C18 trap kolonkou (20×0,3 mm) a separační C18 kolonkou (50×0,3 mm).
• Průtok 5 µL/min, teplota 40 °C, gradient 10–40 % organiky.

Chromatografie analytický průtok (ExionLC AD):

• C18 kolona 50×2,1 mm, průtok 0,5 mL/min, teplota 40 °C.

MS parametry:

• TOF MS sken 100–1000 Da, akumulace 0,1 s.
• MRMHR MS/MS: precursor 535,222 Da, fragmenty 328,209 Da, rozlišení vysoké, výběr fragmentů post-acquisition.
• Zdroje plynů: Curtain gas 25–35, Ion source gas 1/2 = 20–60, napětí 4500–5500 V.

Použitá instrumentace:

• SCIEX TripleTOF® 6600+ se zdrojem OptiFlow™ Turbo V.
• M5 microLC systém.
• ExionLC™ AD HPLC systém (pro srovnávací analýzu).
• Software Analyst TF 1.8 a MultiQuant 3.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání mikroprůtoku a analytického průtoku ukázalo tří­násobné zvýšení citlivosti mikroLC. Workflow MRMHR umožnilo extrahovat vysoce selektivní fragmenty z MS/MS spekter a dosáhnout lepšího poměru signál/šum oproti TOF MS 1 skenu. Optimální šířka extrakčního okna pro XIC byla stanovena na 0,05 Da pro maximální citlivost a selektivitu. LOD 1 pg/mL, LLOQ 2,5 pg/mL, lineární dynamický rozsah 2,5–500 pg/mL, regresní koeficient r=0,99. Přesnost 85–111 %, opakovatelnost (CV) < 7 %.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow microLC-MRMHR poskytuje:

• Výrazné zvýšení citlivosti pro nízké koncentrace peptidů v plazmě.
• Vysokou selektivitu díky HRAMS rozlišování forem s podobným m/z.
• Možnost post-acquisition výběru nejvhodnějších fragmentů pro kvantifikaci.

Metoda je vhodná pro bioterapeutickou analýzu v preklinických i klinických studiích, QA/QC a farmaceutické vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj kombinace mikroprůtokové chromatografie a HRAMS:

• Multiplexní kvantifikace více bioterapeutik v jednom běhu.
• Automatizace post-acquisition optimalizace fragmentů.
• Rozšíření workflow na větší proteiny a konjugované biologické makromolekuly.

Závěr

Prezentovaná microLC-MRMHR metoda na systému SCIEX TripleTOF 6600+ s M5 microLC úspěšně detekuje desmopressin v lidské plasmě od 1 pg/mL a kvantifikuje od 2,5 pg/mL. Díky kombinaci mikroprůtoku a HRAMS došlo k výraznému zlepšení citlivosti a selektivity, přičemž přesnost a opakovatelnost splňují farmaceutické požadavky.

Reference

1. Baghla R., Guttikar S., et al. A Sub-picogram quantification method for desmopressin in plasma using the AB SCIEX Triple Quad™ 6500 System. SCIEX Technical Note.