Universal Solution for Monoclonal Antibody Quantification in Biological Fluids Using Trap-Elute MicroLC-MS Method

Význam tématu

Kvantitativní analýza monoklonálních protilátek v biologických tekutinách je klíčová pro preklinický výzkum, vývoj bioterapeutik a sledování farmakokinetiky. Mikroflow chromatografie v kombinaci s imunokapturou poskytuje významné zvýšení citlivosti a selektivity metody, což je zásadní při detekci ultra nízkých koncentrací v omezeném objemu vzorku. Tento přístup doplňuje tradiční ligandové vazebné testy a minimalizuje vliv matricových interferencí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je popsat obecný workflow spojující imunokapturu a trap-elute mikroflow LC-MS/MS pro ultra-senzitivní kvantifikaci modelové protilátky SILuLite SigmaMAb v myší plasmě. Metodika je navržena tak, aby se dala minimálně upravit pro stanovení libovolné lidské monoklonální IgG ve zvířecích matricích. Práce zahrnuje popis přípravy vzorku, chromatografických podmínek, nastavení hmotnostního spektrometru a výsledků validace.

Použitá metodika a instrumentace

• Imunokaptura: Streptavidinem potažené magnetické kuličky konjugované s biotinylovanou protilátkou proti lidské IgG pro selektivní zachycení target analyta.
• Proteolýza: Digestion eluátů trypsinem/lysine C při 50 °C s následnou inhibicí formiátovou kyselinou.
• Chromatografie: M5 MicroLC systém v trap-elute režimu (1–5 µL/min) s trap C18 kolonkou (Phenomenex Luna 20×0,3 mm) a analytickou kolonkou Kinetex XB-C18 (50×0,3 mm).
• Hmotnostní spektrometrie: QTRAP 6500+ LC-MS/MS se zdrojem OptiFlow Turbo V a SteadySpray™ 25 µm sondou, optimalizace bez mechanických úprav pozice sondy.
• Analýza dat: MultiQuant™ 3.0, jednotlivé MRM přechody pro signature peptidy GPSVFPLAPSSK a FNWYVDGVEVHNAK.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla spodní limity kvantifikace (LLOQ) 2 ng/mL při objemu 25 µL plasmy, s přesností 87–109 % a imprecizností (CV) pod 15 %. Dynamický rozsah pokrývá 1–20000 ng/mL (4,5 dekády) s regresním koeficientem 0,996 (vážení 1/x2). Ve srovnání s konvenční analytickou LC-MS na HPLC systému vykazuje mikroflow režim více než 3násobné zvýšení integrační plochy a více než 2násobné zlepšení poměru signál/šum při nízkých koncentracích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost umožňující stanovení ultra nízkých koncentrací s minimálním objemem vzorku.
• Zkrácený čas přípravy a robustní výkon bez složité optimalizace zdroje hmotnostního spektrometru.
• Univerzální přenositelnost na kvantifikaci jiných IgG bioterapeutik s minimem úprav metodiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace imunokapturálního kroku pro zvýšení provozní výkonnosti.
• Integrace do mikrofluidních platforem pro klinické nebo operativní testování.
• Rozšíření metody na multiplexní kvantifikaci více protilátek současně.

Závěr

Prezentovaná mikroflow immunoaffinity LC-MS/MS metoda nabízí citlivou, reprodukovatelnou a univerzální platformu pro kvantifikaci monoklonálních protilátek v preklinických studiích. Kombinace trap-elute mikroflow chromatografie a selektivní imunokaptury umožňuje dosáhnout LLOQ 2 ng/mL, širokého dynamického rozsahu a vysoké přesnosti bez nutnosti složité optimalizace zdroje. Metoda je připravena k rychlému nasazení v bioanalytických laboratořích pro různé lidské mAbs.

Reference

• Zhang F., Li Y. et al. Quantification of Trastuzumab in Rat Plasma using an Improved Immunoaffinity-LC-MS/MS Method, SCIEX Technical Note.
• AB Sciex. RUO-MKT-02-8279-A.