Targeted Quantification of Cell Culture Media Components by LC-MS

Význam tématu

Optimalizace složení a monitorování změn ve složení živného média a supernatantu během buněčné kultivace je klíčové pro spolehlivý rozvoj bioprocesů. Kvantitativní přehled o aminokyselinách, vitamínech, nukleotidech, organických kyselinách a dalších metabolitech umožňuje zvýšit výtěžek a kvalitu terapeutických produktů.

Cíle a přehled studie / článku

V této poznámce autoři představují univerzální LC-MS/MS metodu pro cílenou kvantifikaci více než stovky sloučenin ve výchozím i vyčerpaném kultivačním médiu. Klíčové body:

• Rychlá analýza bez potřeby derivatizace.
• Relativní kvantifikace i bez komerčně dostupných standardů.
• Dva UPLC chromatografické postupy pokrývající široké spektrum chemických tříd.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků surového média stačilo naředění vodou s 0,1 % kyseliny octové. Supernatant z vyčerpaného média se zpracoval proteinovou precipitací acetonitrilem (2:1), odstředil, pak naředil ředícím činidlem před vstřikem.

Instrumentace:

• LC systém: ACQUITY UPLC I-Class
• Metoda 1 (šířka 2,1×150 mm, 1,8 µm, teplota 40 °C, mobilní fáze 0,1 % HCOOH voda/acetonitril, průtok 0,2 mL/min)
• Metoda 2 (šířka 2,1×100 mm, 1,7 µm, teplota 25 °C, mobilní fáze ACN/H2O + 10 mM NH4HCO3 pH 9, průtok 0,3 mL/min)
• MS detektor: Xevo TQ-S micro, režim ESI +/− switching, kapilární napětí 2,5 kV, teploty 150 °C/500 °C, plyn 1000 L/h
• Software: MassLynx v4.2 s TargetLynx

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala dobré rozlišení a separaci i izomerů (citráty vs. isocitráty, leucin vs. isoleucin). Pro všechny sledované sloučeniny byly dosaženy lineární kalibrační křivky s koeficientem R2 > 0,99. Reprodukovatelnost RT i plošek píků (RSD) byla < 5 %. Opakovatelné měření supernatantů vyčerpaného média přineslo RSD < 5 % pro všechny analyty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Široký rozsah analyzovaných metabolitů v jednom workflow.
• Minimální příprava vzorku bez derivatizace.
• Rychlou importaci parametrů ze sdílené databáze Quanpedia pro standardizaci a vysokou propustnost.
• Možnost relativního kvantifikování i bez referenčních standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření databáze o nové metabolity podle potřeb uživatelů, integrace do on-line monitorovacích systémů bioreaktorů, automatizace přípravy vzorků a využití výsledků v modelech pro strojové učení a predikci produkce.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda představuje rychlý, robustní a všestranný nástroj pro sledování komplexního metabolického profilu buněčných kultur. Výborná reprodukovatelnost, rozlišení izomerů a široké spektrum analyzovaných látek podporují standardizaci a zrychlení bioprocesního vývoje.

Reference

• Paglia G., Langridge J., Astarita G. Development of a Metabolomic Assay for the Analysis of Polar Metabolites Using HILIC UPLC/QTof MS. Center for Systems Biology, University of Iceland; Waters Corporation, Manchester and Milford.
• Bajada S.U., Lu W., Kimball E.H., Yuan J., Peterson C., Rabinowitz J.D. Separation and Quantitation of Water Soluble Cellular Metabolites by Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics & Department of Chemistry, Princeton University; Department of Molecular Biology, Princeton University.