Separation and Analysis of TCA Cycle Analytes by Mixed-Mode Chromatography Coupled with Mass Spectrometry

Význam tématu

Trikarboxylátový (TCA) cyklus je centrální částí buněčného metabolismu, produkující ATP a prekurzory pro syntézu aminokyselin, lipidů a nukleotidů. Malé, polární karboxylové kyseliny TCA cyklu jsou však špatně retinovatelné na klasické reverzní fázi, což komplikuje jejich kvantifikaci a studium v biologických matricích. Vyvinutí robustní LC-MS metody bez nutnosti derivatizace či iontově-párovacích činidel je klíčové pro přesné monitorování metabolitů v klinických a výzkumných aplikacích.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo navrhnout a validovat smíšeně-režimovou chromatografickou metodu kompatibilní s MS pro analýzu TCA cyklu a souvisejících organických kyselin v moči bez derivatizace. Metoda byla aplikována na vzorky moči od zdravých dárců a pacientek s karcinomem prsu a výsledky byly zpracovány multivariační analýzou pro odhalení významných rozdílů.

Použitá metodika

Vzorky moči (4 zdravé, 4 s karcinomem prsu) byly rozmraženy na ledu, naředěny trojnásobkem objemu vody, odstředěny a přeneseny do silanizovaných vialek. Sada system suitability vzorků obsahovala standardní směs 100 µM a stejnou koncentraci navíc v matrix moči. Chromatografie probíhala na kolóně ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl (2,1×100 mm, 1,7 µm) při 50 °C s mobile phase A (0,1 % HCOOH ve vodě) a B (0,1 % HCOOH v ACN). Gradient od 100 % A k 5 % A během 7 minut, návrat k 100 % A do 8,01 minuty, celkový čas 10 minut. Vzorky byly nastříknuty v objemu 3 µL, teplota injektoru 5 °C. Data byla akvírována v kontinuálním MS E módu.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS System
• ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl Column, 2.1×100 mm, 1.7 µm
• Xevo G2-XS QTof Mass Spectrometer (ESI–, MS E)
• MassLynx™ Software v4.2
• Progenesis™ QI Software s vlastní fragmentační a retenční knihovnou

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla dostatečnou retenci a selektivitu pro izolaci kritických izobarických párů citrát/isocitrát (resoluce FWHM = 6) a malát/fumarát (resoluce FWHM = 3,8). PCA skóre ukázalo úzkou shlukovost QC vzorků (vysoká reprodukovatelnost) a jasné rozdělení mezi zdravými a nemocnými vzorky. Identifikace klíčových metabolitů byla potvrzena pomocí fragmentační/retention time knihovny v Progenesis QI (mass error < 8 ppm, ΔtR < 0,15 min).

Přínosy a praktické využití metody

• Žádná nutnost derivatizace či iontově-párovacích činidel, zjednodušení přípravy vzorků
• Rychlá analýza (10 min běh) a vysoká reprodukovatelnost
• Vhodné pro screening metabolitů v klinických studiích a biomarkerové výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na širší metabolomické panely, kvantitativní stanovení a další biologické matice. Předpokládá se integrace automatizovaných pracovních postupů, pokročilých databází fragmentací a vyšších výkonnostních LC-MS systémů pro zrychlení analýzy a rozšíření klinické aplikace.

Závěr

Smíšeně-režimová LC-MS metoda pro analýzu TCA cyklu prokázala výbornou retenci, selektivitu a reprodukovatelnost bez potřeby derivatizace. Aplikace na vzorky moči odhalila významné rozdíly mezi zdravými a karcinomem prsu postiženými jedinci, což potvrzuje užitečnost metody v metabolomických a klinických studiích.

Reference

1. Murray RK, Bender DA et al. Harper's Illustrated Biochemistry, 28th ed., McGraw-Hill, 2009.
2. Vander Heiden MG et al. Cell. 2017;168:657–669.
3. DeBerardinis RJ et al. Cell Metab. 2008;7(1):11–20.
4. Yuan M et al. Nat Protoc. 2012;7:872–881.
5. Luo B et al. J Chrom A. 2006;1147:153–164.
6. van Dam JC et al. Anal Chim Acta. 2002;460:209–218.
7. Patel DP et al. PLoS One. 2017;12:e017...
8. Tan B et al. Anal Biochem. 2014;465:134–147.
9. Smith KM et al. Waters Tech Brief 720006463EN. 2019.
10. Progenesis QI Fragment Database FAQ, Nonlinear Dynamics.