Ion Pairing Free Mixed-Mode Chromatography for the Separation and Measurement of TCA Cycle Metabolites in Urine Samples of Breast Cancer Patients

Význam tématu

Trikarboxylová kyselina (TCA) je centrální součástí buněčného metabolismu, produkující energii (ATP) a prekurzory pro syntézu aminokyselin, lipidů či nukleotidů. Jejích metabolity v biologických vzorcích (např. moči) představují důležité biomarkery pro sledování patologických stavů, včetně nádorových onemocnění. Kvůli malé polaritě a citlivosti na interakce s kovovými povrchy vyžadují tyto organické kyseliny speciální chromatografické přístupy.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout MS-kompatibilní metodiku pro separaci a kvantifikaci TCA metabolitů v moči pacientek s karcinomem prsu bez použití iontových párovacích činidel či derivatizace. Studie představuje mixed-mode anionovou chromatografii na hybridním CSH Phenyl-Hexyl sloupci s MaxPeak HPS povrchem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči byly rozmraženy na ledu, naředěny vodou (100 µL vzorek + 300 µL H₂O), vortexovány, odstředěny (21 130 × g, 10 min, 4 °C) a přeneseny do silanizovaných vial.
Chromatografie:

• LC systém: ACQUITY I-Class PLUS
• Column: ACQUITY PREMIER CSH Phenyl-Hexyl, 1,7 µm, 2,1 × 100 mm s MaxPeak HPS povrchem
• Mobilní fáze A: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B: 0,1 % kyselina mravenčí v ACN
• Gradient: 0–25 % B/4 min; 25–95 % B/3 min; mytí a reekvilibrace
• Průtok: 0,4 mL/min

MS detekce:

• MS systém: Xevo G2-XS QTOF, negativní ionizace
• Software: MassLynx, Progenesis QI

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografická metoda umožnila baseline separaci klíčových izobarických i strukturálně podobných párů: citrát vs. isocitrát, malát vs. fumárát, itakonát vs. cis-aconitát. MaxPeak HPS povrch významně zvýšil návratnost kyselých metabolitů citlivých na metalické povrchy. Reprodukovatelnost byla demonstrována 462 opakovanými injekcemi QC vzorku s nízkou variabilitou retence a plošných integrál.
PCA analýza pěti replik odhalila jasné rozdělení mezi vzorky zdravých a onkologických pacientek a ztěsný shluk QC, což potvrzuje robustnost metody. Abundance profily ukázaly významné rozdíly koncentrací vybraných TCA metabolitů mezi skupinami.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika:

• Vyžaduje minimální přípravu vzorku (žádná derivatizace nebo iontové párování)
• Kompatibilní s vysokoprocesními metabolomickými studiemi
• Vhodná pro klinické laboratoře, QA/QC a farmaceutický výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření mixed-mode chromatografie na další skupiny polárních metabolitů a integrace do automatizovaných high-throughput platforem. Kombinace s novými MS technikami a datovou analýzou (strojové učení) umožní hlubší biomarkerové studie a diagnostiku.

Závěr

Popsaná metoda mixed-mode anionové chromatografie na ACQUITY PREMIER CSH Phenyl-Hexyl sloupci s MaxPeak HPS povrchem poskytuje efektivní, reprodukovatelnou a citlivou analýzu TCA cyklu v moči bez nutnosti iontového párování nebo derivatizace. Demonstrace na vzorcích od pacientek s karcinomem prsu potvrdila její klinický i výzkumný potenciál.

Reference

Abrahamson H, Rezvani A, Brushmiller J. Inorganica Chimica Acta. 1994;226:117–127.
Luo B, Groenke K, Takors R, Wandrey C, Oldiges M. Journal of Chromatography A. 2007;1147(2):153–164.