Structural Characterization of Cyclic Peptides using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer

Význam tématu

Cyklické peptidy představují perspektivní třídu biologicky aktivních látek díky své vyšší stabilitě in vivo a zlepšené buněčné propustnosti ve srovnání s lineárními peptidy. Detailní strukturní charakterizace je klíčová pro vývoj nových léčiv, avšak běžné MS/MS sekvenční metody čelí komplikovaným fragmentačním vzorcům způsobeným cyklickou povahou molekul.

Cíle a přehled studie

Tato studie se zaměřila na vývoj a ověření analytické metody pro detailní strukturální analýzu cyklosporinu A. Pomocí LC v kombinaci s kvadrupólovým TOF hmotovým spektrometrem (LC/Q-TOF MS) autoři usilují o přiřazení všech hlavních fragmentů k předpovězeným fragmentům z molekulové struktury a ověření úplného pokrytí struktury peptidu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl využit systém UHPLC Nexera X2 s analytickou kolonou Shim-pack GISS (2,1×50 mm, 1,9 µm) pracující při 0,3 mL/min a teplotě 50 °C. Mobilní fáze sestávala z 0,1 % kyseliny formiové ve vodě a 0,1 % kyseliny formiové v acetonitrilu v gradientu 60–95 % B.
Pro detekci a fragmentaci posloužil hmotový spektrometr LCMS-9030 (Shimadzu) s elektrosprayem v pozitivním i negativním režimu. Rozlišení přesahuje 30 000 FWHM, hmotnostní přesnost je lepší než 1 ppm a rychlost akvizice až 100 Hz. MS/MS fragmentace probíhala při tlaku 270 kPa s kolizním napětím 55±15 eV.

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční čas cyklosporinu A byl potvrzen na 1,85 min. Přesné měření molekulových iontů [M+H]+ (m/z 1202,8486) a [M+2H]2+ (m/z 601,9279) vykázalo odchylku pod 1 ppm. Softwarové předpovědi elementalního složení pomocí ACD/MS Workbook Suite zcela odpovídaly empirickému vzorci C62H111N11O12.
Všechny významné MS/MS fragmenty byly přiřazeny k předpovězeným produktům štěpení amideových vazeb (a-, b-, c-, x-, y- a z-řady) s hmotnostní chybou do 1 mDa. Díky tomu bylo dosaženo 100% pokrytí strukturního rámce cyklosporinu A.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje jednoznačnou strukturní charakterizaci cyklických peptidů s vysokou přesností.
• Vysoké rozlišení a přesnost hmotových spekter zkracují čas analýzy a snižují nejistoty při identifikaci.
• Aplikace vhodná pro výzkum nových terapeutických cyklických peptidů, kontrolu kvality a farmaceutický vývoj.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj softwarových nástrojů pro automatizované přiřazování fragmentů a integraci dat z MSn analýz rozšíří aplikovatelnost metody na složitější cyklické oligopeptidy a modifikované deriváty. V kombinaci s vysokorozlišenou chromatografií lze očekávat rozšíření do screeningových studií a on-line monitoringu syntézy.

Závěr

Studie prokázala, že LC/Q-TOF MS s vysokou hmotnostní přesností a rozlišením umožňuje kompletní strukturální charakterizaci cyklosporinu A. Přesné přiřazení všech fragmentů s chybou pod 1 mDa a 100% strukturní pokrytí potvrzuje vhodnost metody pro analýzu cyklických peptidů v různých aplikacích.

Reference

1. T. Matsubara, Y. Inohana, I. Hirano; Structural Characterization of Cyclic Peptides using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer; Shimadzu Application Note PO-CON1892E; 2019.