Multiple Mass Spectrometric Strategies for High Selectivity Quantification of Proteins and Peptides

Význam tématu

V oblasti proteomiky roste počet navrhovaných biomarkerů exponenciálním tempem. Pro jejich ověření ve velkých validačních studiích je potřeba vysoce selektivních a citlivých kvantifikačních metod, které zároveň unesou zvýšený průtok vzorků a zjednodušenou přípravu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat tři strategické přístupy měření koncentrace peptidového biomarkeru Brain Natriuretic Peptide (BNP) na hmotnostně spektrometrickém systému QTRAP 5500. Vyhodnocovány byly režimy MRM, MRM3 a SIM doplněné o separaci pomocí diferenční mobility (DMS).

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu matrice bylo plazma s BNP precipitováno acetonitrilem v poměru 1:1, poté ředěno formic acid 0,1 %. HPLC separace proběhla na Shimadzu systému se stacionární fází Thermo Aquasil C18 (2,1×150 mm) za gradientu 2–70 % acetonitrilu při 40 °C a průtoku 300 μL/min. Injekční objem byl 10 μL.

MS/MS analýzy probíhaly na SCIEX QTRAP 5500 vybaveném zdrojem Turbo V. Pro DMS experimenty byla použita modul SelexION® Technology. Kvantifikace se prováděla pomocí softwaru MultiQuant™.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální recoveri BNP v plazmatické matrici poskytl poměr plazma:acetonitril 1:1.
• Obě metody MRM i MRM3 dosáhly LLOQ 128 pg/mL na kolonce (512 pg/mL v matrici) s lineárním rozsahem přes 4,5 dekády a přesností 80–120 %.
• Při režimu SIM bez DMS nebyla picně detekce BNP možná pod úrovní 3,2 ng/mL kvůli výraznému pozadí.
• Zapnutí DMS vedlo ke snížení pozadí a zlepšení S/N poměru, což umožnilo posun LLOQ v režimu SIM až na 128 pg/mL – zlepšení ~25×.

Přínosy a praktické využití metody

• MRM představuje osvědčený a citlivý režim pro peptidy se silným fragmentačním vzorcem.
• MRM3 doplňuje selektivitu další stagí fragmentace a je ideální při rušivých matricích.
• SIM s DMS nabízí alternativní přístup pro peptidy s nízkou fragmentační efektivitou, kdy separace na základě iontové mobility účinně odstraňuje interferující signály.

Budoucí trendy a možnosti využití

Prostor pro další vylepšení LLOQ existuje optimalizací extrakce a přípravy vzorku. Integrace DMS do vícestupňových workflow a využití chemických modifikátorů ve fázích mobilní fáze může dále zvýšit selektivitu. Kombinace s vysokoprocesními chromatografickými technikami a automatizovanou přípravou vzorků zajistí další nárůst throughput.

Závěr

Studie ukázala, že QTRAP 5500 umožňuje tři různě selektivní kvantifikační režimy přizpůsobené konkrétním požadavkům analýzy. Volba mezi MRM, MRM3 a SIM+DMS závisí na fragmentačním chování cílového peptidu a úrovni interferencí v matrici.

Reference

1. MRM Quantitation for Highest Specificity in Complex Matrices. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-2739-A.
2. SCIEX SelexION Technology: A New Solution to Selectivity Challenges in Quantitative Bioanalysis - Differential Mobility Separations Enhanced with Chemical Modifiers. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-3251-A.