Accurate Analysis of Double Stranded DNA over an Extended Size Range

Význam tématu

Analýza dvouřetězcové DNA (dsDNA) je klíčová pro vývoj a výrobu genových a buněčných terapií, DNA vakcín a dalších biotechnologických produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo představit metodiku kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí (CE-LIF) pro přesné stanovení velikosti a koncentrace dsDNA fragmentů v rozsahu 100 bp až 15 kb a porovnat ji s tradičními metodami agarózových gelů a mikročipů.

Použitá metodika a instrumentace

Byla využita CE-LIF na systému PA 800 Plus s detektorem LIF (vzorkovací vlnová délka 488 nm, emisní filtr 520 nm) a softwarem 32 Karat V10.
Gelová matrice a reagencie:

• eCAP dsDNA 1000 kit (gel, test mix)
• LIFluor EnhanCE barvivo
• DNA žebříčky 1 kb a 1 kb plus (Thermo)

Protokol zahrnoval rehydrataci gelu, montáž kapiláry, kalibraci LIF detektoru, přípravu vzorků (2–20 ng/μl) a časové programy pro kondicionování, separaci a uzavření metody.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Baseline separaci 11 fragmentů Hae III digesce φX174 (5386 bp) v 25 min při 12 kV, rozlišení 6–10 bp v oblasti 200–300 bp.
• Kalibraci velikosti s kvartickou křivkou s R² > 0,999.
• Detekční limit 0,79 ng/ml (S/N = 5,4) a kvantifikační limit kolem 1 ng/ml.
• Lineární rozsah 0,79–404 ng/ml (R² = 0,995), dynamický rozsah 2,7 log.
• Opakovatelnost: %RSD < 0,5 % pro dobu migrace a < 2,5 % pro korekturovanou oblast píku.
• Analýzu žebříčků 1 kb a 1 kb plus: přesnost stanovení velikosti do 5–7 % od teoretické hodnoty fragmentů až do 15 kb.

Přínosy a praktické využití metody

CE-LIF metoda umožňuje rychlé a vysoce přesné stanovení velikosti dsDNA fragmentů z restriction digesce plazmidů a virové DNA, analýzu reziduální DNA ve vakcínách a kontrolu kvality genetických konstrukcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na analýzu komplexních genomických vzorků, automatizaci přípravy vzorků a integraci s vysoce výkonnou kapilární elektroforézou pro multi‐parametrické charakterizace.

Závěr

CE-LIF na systému PA 800 Plus s LIFluor EnhanCE a dsDNA 1000 gelem poskytuje spolehlivou alternativu k agarózovým gelům, nabízí širší rozsah velikostí, lepší rozlišení, citlivost a reprodukovatelnost.

Reference

• Guidance for FDA reviewers and sponsors Content and review of CMC information for human gene therapy INDs 2008
• FDA Draft Guidance to Industry Content and review of CMC information for human gene therapy INDs 2018
• Sanger F et al The nucleotide sequence of bacteriophage phiX174 J Mol Biol 1978 125 225-246
• Middleton et al Specific fragments of phiX174 DNA by Haemophilus aegyptius endonuclease Z J Virology 1972 10 42-50
• FDA Guidance to industry Characterization and qualification of cell substrates used in production of viral vaccines 2010
• Shen et al Size analysis of residual host cell DNA in cell culture-produced vaccines by capillary gel electrophoresis Biologicals 2013 41 201-208