Agilent ASMS 2020 Posters Book

Sledování enantioselektivní enzymatické hydrolýzy esterů butyrátu metodou LC–MS

Pro rychlé sledování složitých enzymatických reakcí bylo přidáno jednoduché hmotnostní stanovení na single-quad LC/MSD iQ ke standardnímu chromatografickému přístroji Agilent 1290 Infinity II.

• Reakce: enantioselektivní hydrolýza racemických butyrátových esterů pomocí enzymů L3 a E2.
• Příprava vzorku: přímý odběr alikvot z reakčního roztoku, zastavení reakce pasážováním přes C18 SPE kartuček za studena.
• Chromatografie: 13min rychlý gradient (5→90→5 % methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí) na C18 sloupci, detekce UV i m/z.
• MS detekce: jediný kvadrupól pracuje ve smíšeném režimu scan/SIM (100–500 m/z + SIM na m/z odpovídající substrátu, produktu i meziproduktům).

Základní výsledky a výhody:

• Produkty a substráty bez optického absorbčního maxima byly spolehlivě detekovány pouze na základě m/z.
• Scan data odhalila četné nízkoabundantní meziprodukty i vedlejší produkty ve stejném chromatografickém vrcholu.
• Doplňkový SIM režim umožnil sledovat klíčové ionty (m/z 247, 269 pro substrát; 194, 199, 159 pro produkt).
• Rychlé odběry vzorků s 40s cyklem per injekci u Fast LC nebo 15s u RapidFire přístroje zvýšily propustnost bez ztráty selektivity.
• Podání 24 vzorků prokazuje vysoce reprodukovatelné průběhy tlaků pump i start/stop záznamu MS.
• Rychlá kinetická křivka produktu (<24 h) pro enzym E2 vs. L3 umožnila včasné rozhodování o optimalizaci reakčních podmínek.

Závěr:
Výsledná metoda jedním kvadrupólem je citlivá, selektivní a vysoce propustná, vhodná pro rutinní monitorování enzymatických reakcí, objev meziproduktů a optimalizaci biokatalytických procesů.