Improved Recovery of Polysorbate 80 by Charged Aerosol Detection: Enhancing Performance with a Double Valve Configuration

Význam tématu

Polysorbaty (zejména Polysorbate 80) jsou běžné neiontové tenzidy používané k stabilizaci monoklonálních protilátek ve farmaceutických formulacích. Přesné stanovení jejich obsahu je zásadní pro kontrolu kvality, stabilitu formulací a dodržení regulačních norem. Analytická výzva spočívá v tom, že polysorbaty jsou přítomny v relativně nízkých koncentracích oproti vysoké koncentraci bílkovinné matrice mAb, přičemž polysorbaty postrádají silné chromofory. Charged Aerosol Detection (CAD) je vhodná detekční technika pro tyto látky, ale vyžaduje účinné oddělení proteinu před elucí, aby se minimalizoval vliv matricového rušení na kvantifikaci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ověřit, do jaké míry může konfigurace ventilů v trap-and-elute workflow ovlivnit odstranění proteinové matrice a tím přesnost kvantifikace PS80 pomocí CAD. Studie porovnala tradiční jednoventilové uspořádání s dvojventilovým řešením, které přidává mezikrok „fluid sweep“ pro lepší propláchnutí systémových objemů před vysokoolykanou elucí polysorbátu. Hodnocení zahrnovalo monitorování UV signálu při 280 nm pro detekci proteinového souběhu a kvantitativní spike-recovery testy v různých matricích (NISTmAb a koncentrované mAb vzorky).

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: ACQUITY Premier System s Binary Solvent Manager (BSM).
• Kolona: Oasis MAX, 2.1 x 20 mm, 30 µm.
• Detekce: Charged Aerosol Detector (CAD) + TUV detektor (λ = 280 nm) pro sledování proteinového souběhu.
• Ventilace: jednovenilová konfigurace s ACQUITY Diverter Valve; dvojventilová konfigurace využívající ACQUITY UPLC Column Manager (dva 2-posuvné, 6-port ventily) pro zavedení fluid sweep kroku.
• Mobilní fáze: A = 2 % kyselina mravenčí ve vodě; B = 2 % kyselina mravenčí v isopropanolu (IPA); eluce PS80 probíhá 100 % IPA.
• Podmínky: objem injekce 30 µL; teplota kolony 30 °C; teplota vzorku 10 °C; CAD: sampling rate 5 Hz, time constant Normal, ion trap 600 V, evaporator 40 °C.
• Příprava vzorků: PS80 sklad 20 mg/mL; standardy 0.02–0.50 mg/mL; spike do mAb (koncentrace 10 mg/mL NISTmAb a 50 mg/mL výzkumné mAb) úrovně 0.1, 0.3, 0.5 mg/mL.
• Válce a spotřební materiál: QuanRecovery s MaxPeak HPS viales a předřezaným PTFE silikonovým uzávěrem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Mechanismus problému: během trap-and-elute kroku může část proteinové matrice zůstat v nesmytých objemech fluidiky. Při přepnutí na 100 % IPA se tato reziduální bílkovina uvolní a koeluuje s PS80, což zkresluje CAD signál (CAD je citlivý na hmotnost, nikoliv na chromofory).
• UV monitoring (280 nm) ukázal výrazně vyšší UV signál v eluci při jednoventilové konfiguraci, což indikuje větší koeluci mAb. Dvojventilová konfigurace vykazovala snížený UV signál během eluce, tedy účinnější odstranění proteinové matrice před elucí polysorbátu.
• Spike-recovery výsledky (kvantitativní):

• Ve srovnání s NISTmAb (10 mg/mL) při nejnižší spike úrovni: jednoventil 107.3 % vs. dvojventil 101.6 % (lepší přesnost u dvojventilu). Obě konfigurace měly %RSD < 1 %.
• V náročnější matici 50 mg/mL mAb (kontrolované testy na stejném systému/koloně): při nízkém spike (~0.1 mg/mL PS80) byl recovery 112.2 % pro jednoventil a 105.9 % pro dvojventil. Střední a vysoké spike úrovně: jednoventil 104.1 % a 101.9 % vs. dvojventil 102.8 % a 102.6 % – opět konzistentní posun u dvojventilu blíže k očekávaným 100 %.
• Závěr z dat: přidání fluid sweep kroku pomocí dvojventilové konfigurace snižuje proteinové koeluce a vede k přesnějšímu (méně zkreslenému) kvantitativnímu vyhodnocení PS80, zejména při nízkých hladinách polysorbátu a v matricích s vysokým obsahem proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Dvojventilové zapojení umožňuje lepší kontrolu nad tokem po ukončení trapování a efektivněji proplachuje downstream objemy, čímž se snižuje carryover a koeluce proteinu bez nutnosti měnit chromatografické složení nebo kolonu.
• Metoda zvyšuje spolehlivost CAD kvantifikace polysorbátů v mAb formulacích, což je klíčové pro laboratorní kontroly kvality, vývoj formulací a stabilitní studie.
• Řešení je kompatibilní s existujícími trap-and-elute postupy a lze jej implementovat na platformách ACQUITY Premier bez zásadních změn chromatografického protokolu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace víceúrovňových ventilových konfigurací a optimalizovaných fluidických cest v komerčních LC systémech pro redukci nesmytých objemů a minimalizaci carryover.
• Automatizace fluid sweep kroků v CDS (např. Empower) pro standardizované workflow a snadnější validaci v GMP prostředí.
• Další kombinace orthogonálních detekcí (CAD + UV + MS) pro lepší identifikaci a vyhodnocení potenciálních interferencí a degradačních produktů polysorbátů.
• Vývoj specifických komponent (nižší mrtvé objemy, optimalizovaná těsnění a ventily) a softwarových šablon zaměřených na analysu excipientů v proteinových matricích.
• Regulační a metodické standardizace pro kvantifikaci polysorbátů v biopharmaceutikách, včetně doporučených testů pro hodnocení carryover a koeluce.

Závěr

Studie ukazuje, že konfigurace ventilů v trap-and-elute workflow má přímý vliv na odstranění proteinové matrice a na přesnost CAD kvantifikace PS80. Dvojventilové uspořádání s dedikovaným fluid sweep krokem snižuje reziduální proteinové koeluce, což se projevuje sníženým UV signálem při 280 nm a recoveriemi bližšími skutečným hodnotám, zejména v náročných, vysoce proteinových matricích. Implementace takového řešení představuje praktický způsob, jak zlepšit analytickou spolehlivost bez zásahu do samotné chromatografie.

Reference

1. Martos A.; et al. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and Their Degradation Products in Biopharmaceutical Formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2017, 106(7):1722–1735.
2. Hewitt D.; Zhang T.; Kao T. Quantitation of Polysorbate 20 in Protein Solutions Using Mixed-mode Chromatography and Evaporative Light Scattering Detection. Journal of Chromatography A. 2008, 1215(12):156–160.
3. Bigos P.; et al. Quantification of Polysorbates Using the Waters Charged Aerosol Detector. Waters Application Note. July 2026.
4. Waters. ACQUITY QDa and QDa II Detectors - ACQUITY Diverter Valve Configuration. Waters User Manual, Ver. 02. 715005336.