Quantification of Polysorbates Using the Waters Charged Aerosol Detector

Význam tématu

Polysorbáty (PS20, PS80) jsou klíčové neiontové tenzidy v formulacích monoklonálních protilátek, které zabraňují agregaci, denaturaci a nepřímému adsorpčnímu ztrátám. Analytická kvantifikace polysorbátů je náročná kvůli jejich vysoké heterogenitě, absenci silných UV chromoforů a nízkým koncentracím v matricích obsahujících velmi vysoké koncentrace proteinů. Robustní a reprodukovatelná metoda je nezbytná pro vývoj a kontrolu kvality biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit trap-and-elute RPLC metodu spojenou s detekcí pomocí Charged Aerosol Detector (CAD, Waters) pro kvantifikaci PS20 a PS80 přímo v mAb matricích. Studie zkoumala optimalizaci fluidního uspořádání (duální ventil), vliv parametrů CAD (ion trap voltage, power function value) na linearitu, citlivost a šum a ověřila přesnost pomocí spike-recovery v NISTmAb.

Použitá instrumentace

• LC systém: ACQUITY Premier System s Binary Solvent Manager.
• Detektor: Waters Charged Aerosol Detector (CAD) s nastavitelným ion trap voltage (20–600 V) a PFV.
• Kolona (trap): Oasis MAX, 30 µm, 2.1 x 20 mm.
• Vály a spotřební materiál: QuanRecovery vial s MaxPeak HPS víčkem a preslit PTFE silikonovým uzávěrem.

CAD nastavení použitá při validaci: sampling rate 5 Hz, time constant normal, ion trap 600 V (optimální pro linearitu), evaporation temp 40 °C. Mobilní fáze: A = 2 % kyselina mravenčí ve vodě, B = 2 % kyselina mravenčí v isopropanolu. Teploty: kolona 30 °C, vzorek 10 °C, injekční objem 30 µL.

Použitá metodika

• Trap-and-elute workflow: vzorek je nejprve načten na Oasis MAX jako „trap“, kde za kyselého pH jsou proteiny protonovány a neudrží se (posílány do odpadu), zatímco polysorbáty zůstávají vázány hydrofobně.
• Po odplavení proteinového matriče se přepne ventilace a je aplikována silná organická fáze (100 % izopropanol) pro desorpci a společné eluování heterogenních polysorbátových složek jako jediné široké chromatografické pásmo vhodné pro integraci.
• Duální ventilní konfigurace a downstream switching valve zlepšují opakovatelnost tím, že odplavují nevymyté zóny a zabraňují vniku zbytků proteinů do detektoru.
• Kvantifikace využívá kalibrační křivky připravené z akválních standardů PS20/PS80 (koncentrace 0.005–0.75 mg/mL) a modelování s ohledem na nelineární charakter CAD, optimalizované pomocí PFV a ion trap voltage.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearita: Pro obě látky byla zjištěna vynikající linearita v rozsahu 0.005–0.75 mg/mL (R² ≈ 0.9999) po optimalizaci detektoru.
• Ion trap voltage: Zvyšování napětí ion trapu (až do 600 V) snižovalo základní šum a zlepšovalo linearitu kalibračních křivek, avšak za cenu snížení absolutní signální intenzity. Optimální nastavení tedy představuje kompromis mezi citlivostí a linearitou.
• Duální ventilní konfigurace: Implementace dvojitého ventilu významně snížila %RSD mezi opakováními díky efektivnějšímu proplachu zákoutí a minimalizaci variability způsobené matricí.
• LOD/LOQ: Určeno podle doporučení ICH Q2(R2) ze směrodatné odchylky blanku. Pro PS80 byl LOD 0.002 mg/mL a LOQ 0.006 mg/mL.
• Spike-recovery: Testy v NISTmAb při ~0.1, 0.3 a 0.5 mg/mL (6 replikátů) prokázaly vysokou přesnost a nízkou variabilitu; naměřené hodnoty byly blízké očekávaným (nízké procentní odchylky, nízké %RSD).
• Odlišení PS20 vs PS80: PS80 vykazoval strmější kalibrační sklon než PS20, pravděpodobně v důsledku vyšší průměrné molekulové hmotnosti a větší hydrofobnosti, což zvyšuje efektivitu tvorby aerosolových částic.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje přímou kvantifikaci polysorbátů ve vysokoproteinových matricích bez potřeby komplexní přípravy vzorku.
• CAD poskytuje univerzální odpověď na nevolatilní látky nezávislou na přítomnosti chromoforu nebo ionizovatelné skupiny, vhodnou pro surfaktanty.
• Konfigurace s duálním ventilem a nastavitelné parametry CAD (PFV, ion trap) zvyšují robustnost a přenositelnost metody do kontrol kvality v regulovaném prostředí.
• Integrace s Empower CDS zjednodušuje autorizované zpracování dat, reporting a sledovatelnost (audit trail), což usnadňuje validaci a nasazení v rutinním provozu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace by mohla kombinovat pokročilé modelování PFV/ion trap vztahů pro automatickou adaptaci detektoru podle očekávaného pracovního rozsahu analytu.
• Pokročilé fluidní konfigurace a materiály kolony by mohly zlepšit separaci podskupin polysorbátových složek, což by umožnilo profilování rozkladových produktů a degradantů.
• Integrace CAD s dalšími orthogonalními detekčními technikami (MS, ELSD) může rozšířit diagnostické schopnosti pro rozlišení složek a degradace při vývoji formulací.
• Automatizace metody a centralizované spravování metod v rámci CDS umožní širší nasazení v GMP prostředí a rychlejší přenos mezi laboratořemi.

Závěr

Trap-and-elute RPLC v kombinaci s Waters CAD představuje stabilní, citlivý a reprodukovatelný přístup pro kvantifikaci PS20 a PS80 v biotechnologických formulacích. Optimalizace parametrů CAD (zejména ion trap voltage a PFV) a použití duálního ventilu významně zlepšily liniaritu, snížily šum a zajistily nízké %RSD a přesné spike-recovery výsledky. Díky plné integraci s Empower CDS je metoda vhodná pro nasazení v rámci vývoje i rutinní kontroly kvality.

Reference

1. Martos A; et al. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and Their Degradation Products in Biopharmaceutical Formulations. J Pharm Sci. 2017;106(7):1722-1735.
2. Marine JE; Menon SR; Rumbelow SJ. Chapter 3 - Surfactants (polysorbate and poloxamer): Synthesis, Characterization, and Degradation. Surfactants in Biopharmacuetical Development. 2023:23-57.
3. Fekete S; Ganzler K; Fekete J. Fast and Sensitive Determination of Polysorbate 80 in solutions containing proteins. J Pharm Biomed Anal. 2010;52(5):672-679.
4. Li X; Wang F; Li H; Richardson DD; Roush DJ. The Measurement and Control of High-Risk Host Cell Proteins for Polysorbate Degradation in Biologics Formulation. Antibody Ther. 2022;5(1):42-54.
5. Hewitt D; Zhang T; Kao T. Quantitation of Polysorbate 20 in Protein Solutions Using Mixed-Mode Chromatography and Evaporative Light Scattering Detection. J Chromatogr A. 2008;1215(12):156–160.
6. Shi S; et al. Highly Sensitive Method for the Quantitation of Polysorbate 20 and 80 to Study the Compatibility between Polysorbates and m-Cresol in the Peptide Formulation. J Anal Bioanal Tech. 2015;6:3.
7. Birdsall RE; et al. Predicting Linear Operating Range for Charged Aerosol Detection Using an Inverse Power Function Framework. Waters Application Note. June 2026. 720009440.
8. ICH Q2(R2) Guideline on Analytical Procedure Development. International Council for Harmonisation. November 2023.
9. Birdsall RE; Du X; Bigos P; Han D; Bhiwankar N. Automating Charged Aerosol Detection (CAD) Analysis with Empower CDS Using a Single-Vendor Integrated LC Platform. Waters Application Note. April 2026. 720009297.