Rapid LC-UV-MS Characterization of Peptide Therapeutics and Impurities Using BioResolve™ Peptide Phenyl-Hexyl+ and C18 + RP Columns

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá separace a charakterizace peptidových terapeutik a jejich nečistot je kritická v preklinickém a regulačním procesu i pro rutinní kontrolu kvality. Moderní peptidy (insulin, GLP-1 agonisté, amylin analogy) často obsahují konjugované mastné kyseliny, modifikace a labilní postranní řetězce (oxidace, deamidace, štěpení), které komplikují analytiku. Kombinace reverzní fáze UPLC s hmotnostní spektrometrií umožňuje rychlé oddělení, identifikaci a přesné určení monoisotopických hmotností, což zrychluje rozhodovací cyklus při vývoji a zajišťuje shodu s kvalitou a bezpečností produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí výkonnost dvou peptidových reverzních fází — BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ a BioResolve Peptide C18+ — pro rychlou LC‑UV‑MS analýzu směsi bovinního insulinu, jeho deamidovaného impuritu, GLP‑1 receptor agonistů (semaglutide, liraglutide, tirzepatide) a amylinového analogu cagrilintide. Cílem bylo dosáhnout krátké analýzy (2.1 × 50 mm kolony), baseline rozlišení kritických nečistot (zejména deamidace insulinu), kompatibility s MS a spolehlivé automatizované dekonvoluce intact mass dat.

Použitá metodika

Analýza proběhla v režimu reverzní fáze s krátkými SPP (superficially porous particles) kolony (1.6 µm, 230 Å) 2.1 × 50 mm. Mobilní fáze byla založena na 0.1 % kyselině mravenčí v vodě (A) a acetonitrilu (B) s gradientním elucí od nízkého podílu organiky k vyššímu podílům. Teplota kolony byla 55 °C, UV detekce na 214 nm, objemy injekce 1–5 µL, vzorky připraveny v 0.1 % FA ve vodě:ACN (98:2). Insulin byl záměrně „stárnut“ rozpuštěním v 0.01 N HCl při ~25 °C po dobu 96 h pro generaci deamidovaného impuritu. Vzorky GLP‑1 a amylin analogy byly připraveny v DPBS při 2 mg/mL a ředěny před injekcí tak, aby nálože činily přibližně 0.45–0.91 µg na injekci.

Použitá instrumentace

• UPLC systém: ACQUITY Premier UPLC H‑Class PLUS Bio (ACQUITY Premier UPLC H‑Class PLUS Bio SM FTN‑H, Bio Binary Solvent Manager, column heater).
• Kolony: BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ RP a BioResolve Peptide C18+ RP, 2.1 × 50 mm, 1.6 µm, 230 Å (MaxPeak Premier Technology).
• UV detektor: TUV s analytickou flow cell 500 nL, detekce při 214 nm.
• MS systém: Waters BioAccord LC‑MS System ve MSE módu (pozitivní ionizace, rozsah 50–2000 m/z, scan rate 10 Hz).
• Klíčová MS nastavení: cone voltage 20 V, desolvation 350 °C, capillary 1.2 kV, MSE collision energy ramp 100–150 V, lock mass korekce.
• Software a zpracování: waters_connect Intact Mass Application pro automatizovanou dekonvoluci a Waters Empower pro řízení chromatografie.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rychlá separace: Všechny analyty eluovaly v rozmezí přibližně 5–9 minut. Kritické rozlišení mezi bovinním insulinem a jeho deamidovaným impuritem bylo dosaženo v čase kratším než 6 minut na formátu 2.1 × 50 mm (ΔRT ≈ 0.10–0.12 min).
• Kompatibilita obou stacionárních fází: PH+ i C18+ poskytly srovnatelnou celkovou retencí a kvalitní chromatografii; rozdíly byly však patrné ve specifické selektivitě kvůli π‑π interakcím u Phenyl‑Hexyl+ fáze.
• Selektivita: Mastně‑kyselinové konjugace u GLP‑1 agonistů a cagrilintidu dominovaly retenci, takže konjugované peptidy byly obvykle více retinovány než inzulin i přes menší délku sekvence.
• Rozdíly mezi fázemi: Cagrilintide, semaglutide a liraglutide měly o něco delší retenci na C18+ (o 0.08–0.50 min), zatímco tirzepatide vykazoval přibližně 0.4 min vyšší retenci na PH+ (pravděpodobně vliv kombinace hydrofobních a aromatických interakcí).
• MS charakterizace: Dekonvoluce intact mass dat jasně ukázala ~+1 Da posun pro impuritní formu insulinu, konzistentní s deamidací asparaginu. Obě kolonové chemie vedly k čistým spektrům s dobře definovanými distribučními nabitými stavy, nízkou chybou měření a konzistentními monoisotopickými přiřazeními.
• Robustnost a reprodukovatelnost: Opakované injekce a srovnání obou fází prokázaly malou variabilitu v retenčních časech i v naměřených neutrálových hmotnostech, tedy vhodnost pro rutinní QC a screening.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost a efektivita: Krátké SPP kolony umožňují výrazné zkrácení doby analýzy a snížení spotřeby organického rozpouštědla bez kompromisu v rozlišení.
• Jednotný workflow LC‑UV‑MS: Metoda je plně MS‑kompatibilní a umožňuje v jediné injekci chromatografické rozdělení, UV sledování a přesnou hmotnostní identifikaci.
• Vysoká citlivost pro nečistoty: Baseline separace kritických produkt‑příbuzných nečistot (např. deamidace) usnadňuje kvantifikaci a následné rozhodování v stability a formulaci.
• Automatizované zpracování: Použití waters_connect Intact Mass aplikace zrychluje dekonvoluci a snižuje nutnost ručního zásahu, vhodné pro vysokopropustné laboratory a regulační zprávy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vyšší propustnost: Další optimalizace gradientů a automatizace vzorkování (SPE, 96‑well příprava) povede k ještě rychlejší analýze panelů peptidů pro screening stability a formulací.
• Integrace s vysokorozlišovací MS: Kombinace těchto krátkých separací s HRMS (Orbitrap, TOF) nebo nativními MS přístupy rozšíří schopnost identifikace vzácných modifikací a agregátů.
• Prediktivní chromatografie: Modelování retence peptidů včetně vlivu lipidických konjugací a PTM pro návrh cílených metod bez rozsáhlého empirického optimalizování.
• Regulační adopce: Standardizované, MS‑kompatibilní krátké metody by se mohly stát součástí validačních balíčků pro QC peptidových léčiv.

Závěr

BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ i C18+ RP kolony účinně podporují rychlé LC‑UV‑MS charakterizace peptidových terapeutik a jejich nečistot na krátkém 2.1 × 50 mm formátu. Metoda poskytuje baseline rozlišení kritických nečistot (např. deamidace insulinu) v časech řádu minut, je plně MS‑kompatibilní a spolu se systémem BioAccord a waters_connect Intact Mass umožňuje rychlé, robustní a reprodukovatelné intact mass přiřazení. To z nich činí praktický nástroj pro vývoj, stabilitu a QC peptidových léčiv.

Reference

1. Smith GD, Pangborn WA, Blessing RH. The Structure of T6 Bovine Insulin. Acta Crystallographica Section D 2005;61(11):1476–1482.
2. Heinemann L, Richter B. Clinical Pharmacology of Human Insulin. Diabetes Care 1993;16(Supplement_3):90–100.
3. Brange J, Langkjæ g mla?!, Havelund S, Vølund A. Chemical Stability of Insulin. 1. Hydrolytic Degradation During Storage of Pharmaceutical Preparations. Pharm. Res. 1992;9(6):715–726.
4. Abdelrahman RM, et al. Harnessing GLP‑1 Receptor Agonists for Obesity Treatment: Prospects and Obstacles on the Horizon. J Obes. 2025;2025:9919810.
5. Fox J, Denbigh L, Berger S, Pittman N. Accelerating GLP‑1 Development with High‑Throughput LC‑MS Using the BioAccord LC‑MS System and the INTACT Mass Application; 2025. Waters Application Note 720009176.
6. Fagan A, Bateman LM, O’Shea JP, Crean AM. Elucidating the Degradation Pathways of Human Insulin in the Solid State. J Anal Test. 2024;8(3):288–299.
7. Andrasi M, et al. Determination of Deamidated Isoforms of Human Insulin Using Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 2020;1626:461344.
8. Yang H, Shiner S. Separation of a GLP‑1 Receptor Agonist and Structurally Similar Impurities Using BioResolve Peptide Phenyl‑Hexyl+ and C18+ Columns; 2026. Waters Application Note 720009465.
9. Koza SM, Shiner SJ, Lauber MA. Reversed‑Phase LC‑MS Analysis of Low‑Abundance Impurities in a GLP‑1a Therapeutic Using a Charged Surface 230Å Superficially Porous Phenyl‑Hexyl Column. Waters Application Note 720009507; 2026.
10. Domain E, Kozlova N, Addepalli B, Hanna C, Shiner S. Unlocking Robust, Reproducible Separations for Modern Peptide Therapeutics with BioResolve Peptide Phenyl Hexyl+ Columns. Waters Application Note 720009487; 2026.