RPLC/HILIC Orthogonal Impurity Profiling of Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Analogs Using LC-UV/MS Workflows

Význam tématu

Rychlý nárůst terapeutických analogů GLP-1 zvyšuje nároky na analytické strategie, které musí spolehlivě detekovat a charakterizovat produktové nečistoty. Reverzní fázová chromatografie (RPLC) je široce zavedenou metodou pro peptide, avšak její selektivita založená převážně na hydrofobicitě může být nedostatečná pro rozlišení blízce příbuzných variant (např. deamidace nebo inserce aminokyselin). Integrace ortogonální separace založené na hydrofylitě (HILIC) nabízí komplementární selektivitu a zvyšuje analytické pokrytí, což je klíčové pro bezpečnost, kvalitu a regulaci peptidek během vývoje i rutinní kontroly kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat zjednodušený screening sloupců a integrovaný LC-UV/MS pracovní postup využívající ortogonální selektivity RPLC a HILIC pro komplexní sledování a identifikaci nečistot GLP-1 analogů (konkrétně exenatidu). Studie porovnala schopnost RPLC a dvou typů HILIC fází (BEH HILIC a BEH Amide) separovat klíčové nečistoty, včetně prolinové inserce a několika deamidací, a optimalizovala podmínky HILIC tak, aby byly kompatibilní s MS a vhodné pro implementaci v rutinních pracovních postupech.

Použitá metodika

Vzorky: výzkumné materiály exenatidu a syntetické standardy deamidací. Skladby: zásobní roztok 1 mg/mL v acetátovém pufru pH 4,5, pracovní koncentrace 0,25 mg/mL. Vynucené degradace provedeny v 0,1 M Tris–HCl pH 8 při 37 °C.

Klíčové chromatografické parametry (shrnutí):

• Injekce: 2 µL, teplota vzorku 10 °C.
• RPLC: ACQUITY Premier Peptide CSH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×100 mm, T = 60 °C, mobilní fáze A = 0.1% formiátová kyselina ve vodě, B = 0.1% FA v acetonitrilu.
• HILIC (BEH HILIC): ACQUITY Premier BEH HILIC, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×100 mm, T = 40 °C, mobilní fáze s 50 mM amonným formiátem pH 2.8 a organickou fází s 10 mM amonným formiátem v 10:90 voda:ACN.
• HILIC (BEH Amide): ACQUITY Premier BEH Amide, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm, T = 40 °C, mobilní fáze s 10 mM amonným formiátem pH 3.1 a org. fáze 10:90 voda:ACN.
• Rychlost průtoku: 0.20–0.30 mL/min (závislé na režimu a sloupci).

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém: ACQUITY Premier System s Quaternary Solvent Manager.
• Detekce UV: TUV detektor, λ = 280 nm.
• Mass detector: ACQUITY QDa II, ESI+, full scan 450–1500 m/z, scan rate 5 Hz, capilární napětí 0.8 kV, cone 15 V, teplota sondy 600 °C.
• Software: Empower 3.8.1 pro sběr dat, automatizované porovnání retencí a hmotnostních spekter a generování shodných reportů.

Hlavní výsledky a diskuse

- Raw material screening: RPLC–UV ukázalo 99 % čistotu dle UV signálu, avšak QDa MS odhalil koelující nečistotu s +97.1 Da, která tvořila ~40 % iontového signálu (prolinová inserce). Tato nečistota byla v RPLC obtížně separovatelná i po rozsáhlé optimalizaci, zatímco HILIC dosáhla základního rozlišení (Rs = 2.94) při rychlém gradientu.

- Separace deamidací: syntetické standardy exe-D (28D), exe-E (13E) a exe-DE (obě deamidace) byly testovány. exe-DE (dvojnásobně kyselý) byl separovatelný ve všech režimech. Rozdíl mezi exe-D a exe-E (identický náboj, odlišnost o methylen) byl nejvýzvou: RPLC při velmi mělkém gradientu částečně rozlišil látky, BEH Amide selhala a koelovala, zatímco BEH HILIC dosáhla částečného rozlišení s polovičním časem analýzy oproti RPLC (45 min vs. 114 min), tedy vyšší průchodnosti.

- Optimalizace HILIC: zvyšování ionické síly snižovalo retenci (kompetitivní maskování iontů), nižší pH vedlo ke zkrácení retence (protonace oslabuje elektrostatické interakce). Volba kyseliny jako přísady výrazně ovlivnila tvar a pořadí eluce: formiát (FA) dal nejostřejší píky a nejlepší selektivitu; DFA a zejména TFA snižovaly retenci a TFA dokonce obrátilo pořadí eluce některých deamidací.

- Monitorování degradantů: HILIC metoda identifikovala vynucené degradace včetně exe-D, signálu odpovídajícího succinimidovému meziproduktu (-17 Da) a dominantní isoAsp (+1 Da změna v nom. hmotnosti s odlišnou retencí). Relativní plochy odpovídaly očekávané kinetice succinimidové cesty (isoAsp 3–4× vyšší než Asp). Kombinace RT a MS umožnila spolehlivé označení a automatické flagování nečistot nad reporting threshold (0.05 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Ortogonální kombinace RPLC a HILIC rozšiřuje pokrytí nečistot a snižuje riziko přehlédnutí kritických variant, které UV-only metody nezachytí.
• HILIC s volatilními pufry (amonný formiát) je kompatibilní s MS, což umožňuje přímou integraci do LC-UV/MS pracovních postupů používaných v rozvoji i QC.
• Optimalizované HILIC podmínky mohou zvýšit průchodnost a zároveň udržet nebo zlepšit separaci pro specifické cílové nečistoty (např. deamidace, inserce).
• Automatizované vyhodnocení pomocí Empower CDS zrychluje rozhodování, snižuje manuální zásahy a podporuje stopovatelnost pro regulační dokumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce ortogonálních postupů (RPLC+HILIC) v rutinních QC laboratořích a při surovinovém screeningu; potenciální inkluze do multi-atributních metod.
• Propojení s vysokorozlišujícími MS přístroji pro detailní lokalizaci modifikací a lepší kvantitativní charakterizaci nízko-úrovňových nečistot.
• Vývoj standardizovaných HILIC metod a robustních kritérií pro přenositelnost mezi laboratořemi, včetně validace vlivu pH, ionické síly a ion-pairing aditiv na selektivitu.
• Automatizace screeningu sloupců a adaptivní workflow, které volí optimální režim (RPLC vs HILIC) podle předběžného MS profilu vzorku.

Závěr

Studie ukazuje, že doplnění RPLC o HILIC významně zvyšuje schopnost odhalit a rozlišit příbuzné nečistoty GLP-1 analogů, které by jinak mohly přehlédnout metody založené jen na hydrofobicitě a UV detekci. HILIC nejen doplňuje selektivitu, ale při použití MS-kompatibilních mobilních fází rovněž umožňuje plynulou integraci do existujících LC-UV/MS workflow, zlepšuje průchodnost a podporuje spolehlivou identifikaci a monitorování degradantů relevantních pro bezpečnost a účinnost léčivého přípravku.

Reference

1. Yu M.; et al. Battle of GLP-1 Delivery Technologies. Advanced Drug Delivery Reviews. 2018;130:113.
2. Han D.; Birdsall R.E.; Bhiwankar N. Accelerating Method Development and Manufacturing of GLP-1 Analogs with LC-UV/MS. Application Note, Waters Corporation. 2025.
3. Neale Q.; et al. Chromatographic Properties of Deamidated Peptides with Asn-Gly Sequences in Proteomic Bottom-up Experiments. Journal of Chromatography A. 2024;1738:465513.