Analyte adhesion to LC vials: impact of surface chemistry on recovery at low concentrations

Význam tématu

Analytika stopových koncentrací proteinů a peptidů v LC pracovních postupech je kritická pro vývoj léčiv, QC a bioanalytické metody. Nespecifická vazba (NSB) na povrchy odběrových a analytických nádobek může vést k významným ztrátám analyzátů, nelineárním odpovědím a snížené přesnosti a přesnosti měření. Porozumění vzájemným interakcím mezi analyzátem, rozpouštědlem a povrchem vialu je zásadní pro návrh robustních metod při nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie / článku

Cíl studie byl zjistit mechanismy adheze analyzátů na povrchy LC vialů a kvantifikovat, jak optimalizovaná povrchová chemie a pracovní podmínky ovlivňují recovery zejména při stopových koncentracích. Studie porovnala běžné materiály (neupravené borosilikátové sklo, silanizované sklo, standardní polypropylen), komerční nízko-adsorpční vials a nově vyvinuté GOLD-Grade polypropylenové vialy se silikátovým povlakem, přičemž hodnotila vlivy teploty autosampleru, organického modifikátoru v diluentu, době skladování a objemu náplně.

Použitá metodika a experimentální přístup

Metodika zahrnovala přípravu panelu bioterapeutik a modelových peptidů v referenčních vysokých koncentracích (typicky 100 µg/mL) a v trace koncentracích (různé podle analyzátu). Recoveries se vyhodnocovaly porovnáním plošného signálu stopových koncentrací vůči referenci; u insulinové křivky byl použit i 200 µg/mL jako 100% bod. Pro stanovení vlivů byla aplikována strukturovaná designová matice (DoE) se sledovanými faktory:

• Autosampler teplota: 5 °C vs 25 °C
• Organický modifikátor v diluentu: 0% ACN vs 20% ACN
• Doba skladování v autosampleru: 6, 12, 24 h
• Vial fill volume: 1/3 vs 2/3 objemu
• Materiál vialu: neupravené sklo, silanizované sklo, polypropylen

Analytické podmínky zahrnovaly UHPLC separace na C18/peptidových a RP-phenyl kolonech s DAD detekcí; Chromeleon CDS sloužil k akvizici a zpracování dat. Každé měření bylo založeno na průměru tří po sobě jdoucích injekcí pro určení variability.

Použitá instrumentace

Klíčová instrumentace použitá ve studii:

• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC (System Base Vanquish Duo, Dual Pump F, Split Sampler FT, Column Compartment H)
• Vanquish Diode Array Detector s biokompatibilní semi-micro flow cell (2.5 µL, MP35N)
• Kolony: Hypersil GOLD C18 Selectivity a Hypersil GOLD Peptide pro malé proteiny/peptidy; MAbPac RP Phenyl pro mAb
• Chromeleon Chromatography Data System pro akvizici a zpracování dat
• Vialy a doplňky: Thermo SureSTART různé insertky (skleněné, silanizované), standardní a GOLD-Grade polypropylenové microvialy; silikonové/PTFE septa
• Pomůcky pro přípravu: pipety Finnpipette, vortex

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění studie jsou následující:

• Obecné chování: NSB se stává dominantním problémem při nízkých koncentracích, kdy se zvyšuje poměr povrch/objem a nenasycené vazebné lokality vedou k významným ztrátám signálu.
• Vliv materiálu vialu: GOLD-Grade polypropylen (povrchová úprava obsahující SiO2) vykazoval nejkonzistentnější a nejvyšší recovery napříč širokým spektrem analyzátů. Standardní polypropylen a silanizované sklo často vykazovaly nižší recovery, zejména u některých hydrofobních fragmentů.
• Porovnání s jiným nízko-adsorpčním dodavatelem: komerční Vendor W byl v řadě případů srovnatelný, avšak GOLD-Grade viale vykázaly vyšší citlivost nebo lepší obnovitelnost u vybraných hydrofobních peptidů a u některých fragmentů tryptického digestu.
• Vliv rozpouštědla: přidání 20 % acetonitrilu obecně snižovalo hydrofobní interakce a zlepšovalo recovery u mnoha analyzátů, nicméně složení rozpouštědla musí být voleno s ohledem na stabilitu a rozpustnost analyzátu.
• Vliv pH/acidifikace: u kationických membránově aktivních peptidů (Magainin 2, Mastoparan X) mělo použití 0.1 % TFA v diluentu silný pozitivní efekt — odstranění kyselého modifikátoru vedlo k rozvoji elektrostatických adsorpčních efektů na skleněných površích. GOLD-Grade polypropylen byl vůči těmto změnám méně citlivý a zachoval stabilní recovery i ve vodném diluentu.
• Teplota autosampleru: efekt teploty byl analyzát-dependantní — u některých proteinů teplota zlepšila desorpci, jinde neměla nebo negativně ovlivnila recovery; tedy optimalizace teploty je nutná na úrovni konkrétního analyzátu.
• Doba skladování: delší setrvání v autosampleru občas snižovalo recovery, ale relativní pořadí výkonu vialů zůstávalo stabilní napříč časy; tedy hlavní vliv vychází z koncentrace a povrchových vlastností.
• Objem náplně: v testovaných rozmezích (1/3 vs 2/3) nebyl zjištěn statisticky významný dopad díky geometrickému tvaru dna vialu.
• Peptidové mapování: u tryptického digestu cytochromu c byly pozorovány selektivní ztráty signálu u pozdně eluujících (hydrofobních) peptidů v Level 1 polypropylenu, zatímco GOLD-Grade udržel signál těchto fragmentů nad detekčním limitem.
• Velké proteiny (mAb): u NISTmAb a trastuzumabu hrály povrchové vlastnosti vialu klíčovou roli a GOLD-Grade zlepšoval reprodukovatelnost a relativní recovery.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické implikace pro laboratoře a vývoj metod:

• Při práci se stopovými koncentracemi proteinů/peptidů je volba vialu kritickým krokem vedle optimalizace chromatografických parametrů.
• Povrchově upravené materiály jako GOLD-Grade polypropylen snižují riziko NSB, zlepšují citlivost a opakovatelnost bez nutnosti zásadních změn instrumentace.
• Pro cationické peptidy se osvědčilo použití kyselého diluentu (např. 0.1 % TFA); pro obecné snížení hydrofobních interakcí pomáhá přidání organického modifikátoru (např. 20 % ACN).
• Laboratoře by měly validovat a zvolit vial podle specifických vlastností analyzátů (hydrofobita, náboj, velikost), nikoli pouze podle historických preferencí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a aplikace:

• Další rozvoj povrchově inženýrských materiálů kombinujících inertnost, nízkou adsorpci a kompatibilitu s MS (snížení aduktů).
• Standardizovanější hodnocení nízko-adsorpčních vialů v rámci validačních protokolů bioanalytiky.
• Integrace výsledků povrchových studií s LC–MS/MS metodami pro širší nasazení v PK/PD a stabilitních studiích.
• Mechanistické studie za účelem kvantitativního popisu převažujících interakcí (elektrostatika vs hydrofobita vs vodíkové vazby) a prediktivní testy pro výběr materiálu.
• Optimalizace pro automatizované workflow a multiwell formáty s nízko-adsorpčními povrchy.

Závěr

Studie potvrzuje, že při analýze proteinů a peptidů na stopových úrovních významně ovlivňuje výsledky povrch vialu a volitelné pracovní podmínky. Kombinace metodické optimalizace (rozpouštědlo, pH, teplota, plán injekcí) a použití povrchově upravených vialů (GOLD-Grade polypropylen) vede k lepší obnovitelnosti, citlivosti a přesnosti. Neexistuje univerzální vial vhodný pro všechny analyzáty; výběr by měl být založen na vlastnostech analyzátu a experimentálních testech.

Reference

1. Maes K., Smolders I., Michotte Y., Van Eeckhaut A. Strategies to reduce aspecific adsorption of peptides and proteins in liquid chromatography-mass spectrometry-based bioanalyses: an overview. Journal of Chromatography A. 2014;1358:1-13.
2. Jung M. C. Achieving Maximum Protein and Peptide Recovery, Sensitivity, and Reproducibility using QuanRecovery Vials and Plates. Waters white paper, 720006571E, 2019.
3. Mathes J. Protein adsorption to vial surfaces - quantification, structural and mechanistic studies. Cuvillier Verlag, 2010.
4. Kristensen K., Henriksen J. R., Andresen T. L. Adsorption of Cationic Peptides to Solid Surfaces of Glass and Plastic. PLOS ONE. 2015;10(5):e0122419.