Having your cake and eating it, too: A novel quantitative LC-HRAM bile acids workflow incorporating robust quantitative and discovery capabilities

Význam tématu

Biologická role žlučových kyselin (ŽK) a jejich konjugátů se ukazuje být klíčová v řadě onemocnění a metabolických drah. Přesné a reprodukovatelné kvantifikace ŽK jsou nezbytné pro klinický výzkum, farmakologii a metabolomiku, avšak tradiční nontargeted přístupy narážejí na problémy s fragmentací, standardizací a mezilaboratorní srovnatelností. Poster představuje workflow, který kombinuje kvantitativní přístup „gold-standard“ s vysokorozlišovacími HRAM daty pro současné absolutní kvantifikace a objevování nových analytů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vytvořit uživatelsky přívětivý, přenosný a validovaný balíček pro absolutní kvantifikaci ŽK napříč laboratořemi, přičemž zachovat možnost nontargeted objevů z LC-HRAM dat. Součástí bylo sestavení komerčního kitu MoveKit BA (reagencie, QC, stabilně značené standardy) a doprovodné aplikace MoveApp pro plánování, zpracování, vizualizaci QC a reportování.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Extrahované materiály: lidská a myší séra, lidský fekální extrakt (NIST), SRM1950 a další biologické matrice.
• Extrakce: 96-jamkové uspořádání s metanolem obsahujícím stabilně izotopově značené (SIL) ŽK, amonium acetát a filtračním krokem na skleněném vláknovém filtru. Postup optimalizován pro vysokou propustnost (plate <30 min).
• Chromatografie: BEH C18 kolona, gradient 9,5 min, průtok 0,3 mL/min (inject-to-inject ~10 min).
• Kalibrace: novelní Single-Point External Calibration (SPEC) s vestavěnými multipoint QC v kitu; matrikové kalibrátory (matrix-based) byly preferované pro lepší recovery a přesnost oproti vodným nebo MeOH/sůl systémům.
• Data: HRAM LC-MS/MS (nontargeted datová akvizice) kombinovaná s knihovnou a algoritmy pro automatické přiřazení špiček a kvantifikaci.

Instrumentace (specifická):

• Orbitrap platformy Thermo Scientific.
• Stellar hmotnostní spektrometry.
• BEH C18 kolona (Waters).
• MoveKit BA reagencie a MoveApp software (Move Analytical LLC).

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové výstupy:

• Rozsah analyzovaných sloučenin: sestava obsahuje 16 konjugovaných a nekonjugovaných ŽK a jejich sulfátované analogy; celkově v rámci workflow je pokryto 32 kvantitativních analyzovaných ŽK a až 155 sloučenin (včetně ~123 semi‑kvantitativních žlučových a mastných kyselin).
• Výkonnost: doba mezi injekcemi ~10 minut; automatické přiřazení špiček trvá jen několik sekund na vzorek; zpracování dat a kvantifikace v MoveApp trvá řádově desítky minut (procesování ~15 min).
• Robustnost kalibrace: Single-point externí kalibrace validačně vykázala výsledky s biasem v rámci ±20 % ve srovnání s tradiční multipoint kalibrací; použití matrikových kalibrátorů zlepšilo návratnost a přesnost.
• Mezilaboratorní validace: metoda byla cross-validována v šesti laboratořích na různých Orbitrap a Stellar přístrojích; při splnění datové kontroly MoveApp byla přesnost přiřazení kritických párů ŽK výrazně lepší než přístup založený pouze na iRT v nástrojích typu Skyline.
• QC a operativní monitorování: MoveApp implementuje systém System Suitability Test (SST) s kontrolou retence, rozlišení kritických párů, tvaru gradientu a kalibrace m/z; vizualizace QC ukazuje automaticky bias a linearitu pro QC low/high a studijní pooly, umožňuje rychlou identifikaci problémů (např. pipetáž, carryover, chybná příprava).

Diskuse:
Work‑flow efektivně spojuje kvantitativní přesnost s otevřeností HRAM dat pro objev nových konjugátů. Software‑řízené operativní QC snižuje čas a náklady spojené s forenzní diagnostikou selhání a zlepšuje mezilaboratorní reprodukovatelnost. Matriková kalibrace a použití SIL standardů jsou klíčové pro zajištění vysledovatelnosti výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Rychlá a plně vybavená workflow (kompletní reagencie a softwarová podpora) vhodná pro rutinní i výzkumné laboratoře.
• Kvantitativní výsledky s důrazem na reprodukovatelnost mezi laboratořemi — vhodné pro multi‑center studie a standardizaci dat.
• Současné získání HRAM dat umožňuje objevování doplňkových metabolitů bez nutnosti separátního nontargeted běhu.
• Automatizované kontroly kvality a vizualizace zkracují rozhodovací cyklus a snižují riziko nákladných chyb.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření knihoven a standardů pro širší spektrum konjugovaných a modifikovaných ŽK (sulfáty, glukuronidy apod.).
• Integrace s dalšími platformami a datovými standardy pro lepší interoperabilitu mezi laboratořemi a databázemi metabolomiky.
• Regulační validace a standardizace workflow pro klinické použití a diagnostiku, včetně robustness pro biobankované vzorky.
• Vylepšení nontargeted identifikace pomocí strojového učení a retrospektivní analýzy HRAM dat pro objevy biomarkerů.

Závěr

MoveKit BA a MoveApp představují integrované řešení, které umožňuje spolehlivou absolutní kvantifikaci žlučových kyselin při zachování schopnosti nontargeted objevů z HRAM dat. Klíčové komponenty jsou matriková kalibrace, stabilně značené interní standardy, krátká chromatografie a operativní softwarové QC. Mezilaboratorní validace potvrzuje použitelnou přesnost a reprodukovatelnost, což tento přístup činí atraktivním pro výzkum i nasazení v diagnostice.

Reference

Poster: Thompson J.W., Amer B., Bird S.S., Percy A.J., Campbell J.P., Mellors J.S. Having your cake and eating it, too: A novel quantitative LC‑HRAM bile acids workflow incorporating robust quantitative and discovery capabilities. ASMS 74th Annual Conference, 2026. Move Analytical LLC; Thermo Fisher Scientific; Cambridge Isotope Laboratories. MoveKit BA a MoveApp (Move Analytical LLC).