Sensitive and robust quantitation of serum bile acids using a novel quantitative kit on Stellar MS to study Crohn’s disease

Význam tématu

Analýza žlučových kyselin v krvi je klíčová pro pochopení metabolických a střevních onemocnění, jako je Crohnova choroba. Nízké endogenní koncentrace, velká strukturální podobnost jednotlivých žlučových kyselin a přítomnost konjugovaných a sulfátových forem kladou vysoké nároky na citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost analytických metod. Standardizované, rychlé a robustní kvantitativní postupy umožňují provádět velké kohortní studie a zvyšují klinický i výzkumný přínos měření profilu žlučových kyselin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu pro kvantifikaci 32 žlučových kyselin (včetně 16 sulfátovaných forem) pomocí komerčního kitu MoveKit BA integrovaného se spektrometrem Thermo Scientific Stellar MS. Studie hodnotí jak analytickou výkonnost (LLOD, selektivita, rychlost), tak biologické rozdíly mezi sérem pacientů s Crohnovou chorobou a věkově shodnými zdravými kontrolami. Součástí bylo i mezilaboratorní porovnání výsledků mezi dvěma laboratořemi.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorkovací materiál: sérum (také ověřeno na moči a fekáliích). Objem vzorku 20 µL; injektováno 5 µL extraktu.
• Příprava vzorků: vysrážení v prostředí s vysokým organickým podílem, ochlazení na −20 °C, filtrace přes skleněnou filtrační destičku a centrifugace; 96-jamkové destičky doplněné kalibracemi v matrix, QC (high/low) a pooled QC.
• Kit a interní standardy: MoveKit BA (Move Analytical LLC); zařazeny hmotnostně značené interní standardy od Cambridge Isotope Laboratories; kvantifikace relativně k odpovídajícím značeným standardům.
• Chromatografie: reverzní fáze na C18 kolonce (rychlá metoda ~9,5 minuty); v multi-lab srovnání byly použity mírně odlišné C18 kolony.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Stellar MS, cílená PRM analýza v negativním ionizačním módu; využití kombinace HCD a CID fragmentace (část analyzovaných látek kvantifikována přes fragmenty MS2).
• Software a řízení dat: Thermo Scientific Xcalibur a MoveApp pro generování sekvencí, real-time kontrolu kvality, zpracování dat a základní statistiku.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda umožnila kvantifikaci 32 cílových žlučových kyselin včetně 16 sulfátovaných forem; pro 31 z 32 analyzovaných látek bylo kvantování založeno na MS2 fragmentech.
• Limit detekce (LLOD) se pohyboval v nízkých nM hodnotách pro většinu analyzovaných látek; sulfátované formy vykazovaly obecně velmi nízké LLOD (některé ~1–3 nM).
• Rychlost a jednoduchost: jednoparametrová (one-point) kalibrace v rámci destičky a krátký chromatografický běh umožňují vysokou propustnost pro kohortní studie.
• Fragmentační optimalizace: 15 z 32 analytů poskytlo vyšší intenzitu fragmentů při použití CID; některé analyty (např. UDCA) nevytvářely výrazné MS2 fragmenty při vysokém HCD NCE, což ovlivnilo výběr aktivace pro kvantifikaci.
• Biologické rozdíly u Crohnovy choroby: statistická analýza ukázala významné změny profilu žlučových kyselin v séru pacientů s Crohnovou chorobou v porovnání se zdravými kontrolami. Konjugované sekundární žlučové kyseliny vykazovaly vysoký fold change; významné snížení TDCA v souvislosti s Crohnovou chorobou koreluje s literaturou. Navíc byly identifikovány několika sulfátované žlučové kyseliny dosud nepopsané v séru pacientů s Crohnovou chorobou.
• Mezilaboratorní reprodukovatelnost: výsledky z Thermo Fisher (San Jose) a laboratoře UNC byly v dobré shodě pro testované matice (fekálie, sérum, moč). Menší rozdíly v určených koncentracích (např. vyšší koncentrace ve fecesu v San Jose) mohou souviset s použitím odlišných C18 kolonek a s chromatografickým rozlišením některých komplikovaných špiček.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita umožňují analýzu nízkokoncentrovaných žlučových kyselin v séru, což je zásadní pro klinické studie a biomarkerový výzkum.
• Krátký běh LC a jednoduchá příprava vzorků zvyšují laboratorní kapacitu a snižují náklady na analýzu velkých souborů vzorků.
• Inkluze rozsáhlé sady značených interních standardů podporuje přesnost a kompenzaci matrix efektů, což je důležité pro srovnatelnost výsledků mezi běhy a laboratořemi.
• Možnost detekce a kvantifikace sulfátovaných forem rozšiřuje metabolomický profil žlučových kyselin a otevírá nové poznatky o patologii střevních onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další standardizace metody a rozsáhlejší mezilaboratorní studie povedou k zavedení postupů do klinických a diagnostických laboratoří.
• Rozšíření panelu o další konjugáty a oxidované formy a hlubší integrace s jinými omickými daty (mikrobiom, proteomika) pro komplexní biomarkerové studie.
• Automatizace přípravy vzorků a dálkové monitorování kvality dat mohou zvýšit throughput a spolehlivost v multicentrických studiích.
• Využití vyšších MSn možností Stellar MS k lepšímu rozlišení izomerů a potvrzení struktury nově pozorovaných sulfátovaných látek.
• Optimalizace chromatografie (cílené kolony) pro lepší rozlišení kritických izomerů a minimalizaci matrice interference.

Závěr

Popsaná metoda kombinující MoveKit BA a Stellar MS poskytuje rychlou, citlivou a robustní cestu ke kvantifikaci širokého spektra žlučových kyselin v biologických matricích. Metoda vykazuje slibnou reprodukovatelnost mezi dvěma nezávislými laboratořemi a odhalila biologicky významné změny profilu žlučových kyselin u pacientů s Crohnovou chorobou, včetně dosud málo popsaných sulfátovaných forem. Další validace a standardizace by mohly umožnit širší aplikaci této metodiky ve výzkumu i klinické praxi.

Reference

• Remes PM, et al. Hybrid Quadrupole Mass Filter-Radial Ejection Linear Ion Trap and Intelligent Data Acquisition Enable Highly Multiplex Targeted Proteomics. Journal of Proteome Research. 2024.
• Sun R, Jiang J, Yang L, Chen L, Chen H. Alterations of Serum Bile Acid Profile in Patients with Crohn's Disease. Gastroenterology Research and Practice. 2022;2022:1680008.