New Derivatization Method for Quantitative Analysis of Δ⁹-THC-COOH in Urine

Význam tématu

Analýza 11-nor-9-karboxy-Δ9-tetrahydrokanabinolu (Δ9-THC-COOH) v moči je klíčová pro potvrzení užití konopí v soudně-lékařských a toxikologických aplikacích. Tradiční kvantifikace pomocí LC-MS/MS spoléhá na stabilně izotopově značené interní standardy, které mohou být obtížně dostupné a náchylné na dodavatelské či celní komplikace. Studie navrhuje derivatizační postup s činidlem IPPAH a jeho izotopovým ekvivalentem IPPAH-d6, který umožňuje jednoduchou a levnou přípravu interního standardu přímo v laboratoři, přičemž zachovává citlivost a kvantitativní přesnost potřebnou pro rutinní vyšetření.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a ověřit novou derivatizační metodu pro kvantifikaci Δ9-THC-COOH v moči, která umožní současně syntetizovat stabilně izotopově značený interní standard (Δ9-THC-COOH-IPPAH-d6). Studie demonstrovala syntézu derivatizačního činidla IPPAH/IPPAH-d6, konjugaci s analytem pomocí HSTU za pokojové teploty a následnou analýzu derivátů LC-MS/MS s hodnocením linearity, přesnosti, opakovatelnosti a účinnosti derivatizace.

Použitá instrumentace

• LC: Nexera XR (Shimadzu)
• Kolona: Raptor ARC-18, 100 mm × 3.0 mm I.D., 1.8 µm (Restek)
• MS: LCMS-8050 (Shimadzu), pozitivní ESI, MRM režim
• Sjednocené příslušenství: MonoSpin C18 spin kolony (GL Sciences) pro čistění

MS parametry (ukázkové): nebulizér 3 L/min, drying gas 5 L/min, heating gas 15 L/min, DL 150 °C, heat block 300 °C, interface 400 °C. Kolona 40 °C, injekce 2 µL, mobilní fáze: 10 mM ammonium formiát + 0.1 % kyseliny mravenčí (voda) a v methanolu; průtok 0.4 mL/min; gradient predominantně na organické fázi (75–85 % B pak návrat na 30 %).

Použitá metodika

Syntéza derivatizačních činidel:

• Výchozí látky: 4-piperidinecarboxylic acid ethyl ester a acetone nebo acetone-d6.
• Redukce: sodium triacetoxy borohydride v chloroformu s acetikou, mísení 3 dny při RT → extrakce a koncentrace organické fáze.
• Hydrazinolýza: reakce s 20 % hydrazinem v etanolu při 70 °C po 20 h → vakuové odpaření a extrakce → získání IPPAH nebo IPPAH-d6.

Příprava interního standardu (Δ9-THC-COOH-IPPAH-d6):

• Δ9-THC-COOH v methanolu, přidání IPPAH-d6 a aktivátoru HSTU (100 mM v ACN), reakce 30 min při pokojové teplotě.
• Čištění přes MonoSpin C18: kondicionace, aplikace reakční směsi, oplach, eluace a koncentrace → rekonstituce v MeOH (1 µg/mL).

Předúprava močového vzorku a derivatizace:

1. Hydrolýza: 100 µL moči + 10 µL 10 M NaOH, ohřev 15 min při 50 °C (dekonjugace glukuronidů).
2. Neutralizace 50 % TFA, precipitace proteinů přidáním 1 mL acetonitrilu, centrifugace a vysušení supernatantu pod dusíkem.
3. Rekonstrukce v 20 µL MeOH, přidání 10 µL interního standardu (20 ng/mL), IPPAH (40 mg/mL v MeOH:ACN 2:8 s 0.5 % pyridinem) a 40 µL 100 mM HSTU; derivatizace 30 min při RT.
4. Kyselá úprava, čištění přes MonoSpin C18, eluace, vysušení a rekonstituce v 50 µL 50 % MeOH před LC-MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kvalifikační metrika: kalibrační křivka 1–500 ng/mL byla lineární s korelačním koeficientem R ≥ 0,998.
• Citlivost: jasná detekce při 5 ng/mL; dolní mez kvantifikace (LLOQ) ≤ 1 ng/mL pro nederivatizovaný zbytek analytu.
• Přesnost a opakovatelnost: intra-denní testy (n = 5) ukázaly pro 15 ng/mL průměr 13.2 ng/mL (accuracy 87.7 %, %RSD 5.7 %) a pro 200 ng/mL průměr 200 ng/mL (accuracy 100 %, %RSD 6.4 %).
• Účinnost derivatizace: MRM chromatogramy při nejvyšší kalibrační úrovni (500 ng/mL) ukázaly, že nereagovaný Δ9-THC-COOH byl pod LLOQ (< 1 ng/mL), tj. derivatizace ≥ 99 %.

Diskuse zdůrazňuje, že derivatizace s IPPAH/IPPAH-d6 dává stabilní a vysoce účinné deriváty vhodné pro MRM kvantifikaci, přičemž izotopově značený derivát syntetizovaný přímo z analytu poskytuje korekci matrice obdobně jako komerční ISTD. HSTU se ukázal jako efektivní aktivátor, reakční doba krátká (30 min) a podmínky mírné (RT), což usnadňuje integraci do rutinních workflow.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení závislosti na externích dodavatelích stabilně izotopově značených standardů; možnost lokální a levné přípravy ISTD z dostupných reagentů.
• Vysoká účinnost derivatizace a nízké LLOQ umožňují detekci i v kontextu přísných soudně-lékařských limitů (např. cut-off 15 ng/mL).
• Rychlý průběh reakce a použití spin-kolony zkracují dobu přípravy a usnadňují implementaci do rutinní analýzy v toxikologických laboratořích.

Omezení a doporučení pro praxi

• Laboratoř musí mít základní organické-syntetické schopnosti a bezpečné zázemí pro práci s hydrazinem a redukčními činidly.
• Je potřeba validovat metodu v daném provozu, včetně stabilitních studií derivátů, mezidenní repetability a studia matrice různých typů močových vzorků.
• Doporučuje se stanovit procedury kvality pro syntézu IPPAH-d6 a sledovat izotopovou čistotu a výtěžnost ISTD.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření principu izotopově značené derivatizace na další karboxylové toxikanty a léková metabolity pro snížení závislosti na komerčních standardech.
• Automatizace derivatizačního kroku a integrace s robotizovanou přípravou vzorků pro vyšší průchodnost a reprodukovatelnost.
• Multiplexní metody, které umožní současnou kvantifikaci více kyselých metabolitů využívajících stejný derivatizační přístup.
• Standardizační snahy a mezi-laboratorní studie vedoucí k širšímu přijetí metody v forenzní praxi a klinických laboratořích.

Závěr

Metoda založená na derivatizaci Δ9-THC-COOH s IPPAH a použití syntetizovaného izotopového interního standardu IPPAH-d6 nabízí efektivní, citlivý a praktický přístup pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu tohoto forenzně významného biomarkeru. Postup minimalizuje logistická rizika spojená s importem komerčních ISTD, dosahuje vysoké účinnosti derivatizace (>99 %) a splňuje požadavky na přesnost a přesnost potřebné pro rutinní testování moči.

Reference

• Kawasue S., Kuniyoshi K., et al. (2026) Novel isotope-coded derivatization of carboxylic acids provides accurate quantification of Azaspiracids in shellfish by liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B, 1267, 124826.