Aflatoxin Immunoaffinity Chromatography with Automated Vacuum Manifold

Význam tématu

Mykotoxiny, zejména aflatoxiny, jsou vysoce toxické a karcinogenní metabolity plísní, které přežívají technologické zpracování potravin a kumulují se v tučných tkáních. Přítomnost aflatoxinů v zemědělských komoditách (kukuřice, arašídy apod.) podléhá přísným regulačním limitům, což vyžaduje spolehlivé, reprodukovatelné a vysoce průchodné analytické postupy. Tradiční imunizační afinitní očistné sloupce podle AOAC 991.31 poskytují selektivitu, ale jsou často manuálně náročné a citlivé na kontrolu průtoku, což omezuje efektivitu v laboratorích s vysokou propustností vzorků. Automatizace přípravy vzorků může snížit chybovost, zvýšit průchodnost a zajistit konzistentní kvalitu výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsané práce bylo adaptovat a ověřit automatizovaný pracovní tok pro imunizační afinitní očistu aflatoxinů využívající vakuový multifunkční systém Extraction+ ve spojení se softwarovým řízením OneLab a automatizovaným pipetovacím modulem Pipette+. Studie porovnává výkon tohoto uspořádání s očekávanými parametry AOAC 991.31 a hodnotí liniaritu, přesnost, reprodukovatelnost, odolnost vůči složitým matricím a provozní přínosy (propustnost, snížení ruční práce, integrace s LIMS a Empower softwarem).

Použitá metodika a instrumentace

Postup vzorkování a očisty vycházel z AOAC Official Method 991.31 s následujícími klíčovými kroky:

• Vstupní matrice: 25 g mleté kukuřice smíchané s 5 g NaCl a 125 mL 70 % methanolu, extrakce 2 min vysokorychlostním mixováním.
• Filtrace: gravitační filtrace přes záhybový filtrační papír a následné filtrování přes mikrovláknový filtr po zředění.
• Očista: 15 mL dvojitě filtrovaného extraktu naloženo na AflaTest imunizační afinitní kartuši; promytí vodou (dvakrát po 10 mL) a eluace 1,0 mL methanolem; následné ředění eluátu 1:1 s vodou před injekcí.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class PLUS s FLR detektorem; kolona ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8 µm, 2.1 x 100 mm); izokratická mobilní fáze 45 % methanolu, průtok 0,350 mL/min; doba běhu 6 minut; objem injekce 5 µL.
• Detekce: fluorescence, excitace 360 nm, emise 440 nm, PMT gain 1.00, datová rychlost 10 bodů/s.

Specifická instrumentace a softwarová výbava použitá ve studii (samostatná sekce):

• Extraction+ connected device vacuum manifold (automatizovaná vakuová jednotka s programovatelnými tlak. gradienty)
• Pipette+ connected automated pipetting device
• OneLab software pro řízení pracovních postupů a integraci s LIMS
• ACQUITY UPLC H-Class PLUS System s FTN a ACQUITY UPLC FLR Detector
• AflaTest immunoaffinity cartridges (VICAM)
• Empower software (Ver. 3.6.1) pro zpracování chromatografických dat

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný vakuový multifunkční systém vykázal následující klíčové výsledky:

• Liniarita: velmi dobrá lineární závislost signálu v rozsahu 0.1–100 ng/g pro aflatoxiny B1, B2, G1 a G2 (R² ≥ 0.995).
• Přesnost a návratnost: průměrné recoverie 95–110 % a meziběžná variabilita pod 10 % RSD, což odpovídá požadavkům AOAC úrovně výkonu.
• Reprodukovatelnost a robustnost: programovatelné vakuové tlakové gradienty udržely kontrolované průtoky a výrazně omezily riziko ucpání i u viskózních a částicemi bohatých matric.
• Propustnost a efektivita: kompaktní konfigurace umožnila souběžnou očistu až 24 vzorků a zkrácení času obsluhy na polovinu ve srovnání s ruční přípravou.
• Software a integrace: OneLab umožnil řídit asistované i plně automatické pipetovací kroky, přímou integraci se systémem LIMS a automatizovaný přenos sekvencí do Empoweru, čímž se snížilo riziko lidských chyb a zvýšila stopovatelnost.

Diskuse zdůraznila, že automatizovaný vakuový přístup může nahradit pozitivní tlakové pumpy při menším zatížení a srovnatelné analytické výkonnosti. Kontrolované vakuové gradienty poskytly stabilní načítání a eluaci z afinitních sloupců, čímž se minimalizovala variabilita mezi operátory. Testy byly provedeny na kukuřici – přenositelnost na jiné matrice (arašídy, másla z arašídů, atd.) vyžaduje další validaci.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody zavedení Extraction+ pracovního postupu v laboratorním provozu zahrnují:

• Snížení ruční práce a času obsluhy až o ~50 %, což snižuje náklady na práci a chyby operátora.
• Zvýšení kapacity testování díky paralelní očistě 24 vzorků na malém prostoru.
• Zachování AOAC-kompatibilní selektivity a analytické citlivosti pro čtyři hlavní aflatoxiny bez nutnosti zásadní změny analytických podmínek.
• Robustní průtoková kontrola, která snižuje ucpání sloupců a zlepšuje kontinuální provoz při práci s náročnými matricemi.
• Plná digitální stopovatelnost a snazší soulady s dokumentací díky integraci OneLab, LIMS a Empower SW.

Budoucí trendy a možnosti využití

Na základě výsledků studie lze očekávat několik směrů dalšího vývoje a aplikací:

• Rozšíření validace na širší spektrum potravinářských matric (arašídy, olejnatá semena, potravinové doplňky) a vícerozborové mykotoxinové panely.
• Další automatizace kroků extrakce a předúpravy, včetně online couplingu k LC systémům pro úplnou automatizaci OD vzorku po data.
• Integrace s pokročilými LIMS/ELN řešeními a využití strojového učení pro predikci poruch a optimalizaci tlakových profilů.
• Miniaturizace a škálování pracovníků pro vysokopropustné screeningové laboratoře a rutinní kontrolu kvality v potravinářství.
• Regulační akceptace automatizovaných postupů jako alternativy k manuálním protokolům na základě kumulativních validačních dat.

Závěr

Studie ukázala, že použití Extraction+ vakuového přístroje řízeného přes OneLab a s podporou Pipette+ umožňuje provádět imunizační afinitní očistu aflatoxinů podle principů AOAC 991.31 srovnatelné analytické výkonnosti. Systém nabízí vyšší propustnost, sníženou závislost na operátorovi a robustní kontrolu průtoku, přičemž dosahuje vynikajících lineárních parametrů, návratností a reprodukovatelnosti pro aflatoxiny B1, B2, G1 a G2 v kukuřici. Plná softwarová integrace zjednodušuje správu vzorků a přenos dat do chromatografického zpracování, což činí navržený pracovní tok atraktivním řešením pro rutinní QA/QC laboratoře.

Reference

1. AOAC INTERNATIONAL. Aflatoxins in Corn, Raw Peanuts, and Peanut Butter, Immunoaffinity Column (AflaTest) Method 991.31, 2005.
2. Sun T., Dreolin N., Hird S., Collette N. Analysis of Aflatoxins in Corn and Peanuts Using Immunoaffinity Chromatography and the Arc HPLC System, Waters Application Note 2023.
3. Benvenuti M.E., Di Gioia A.J. Rapid Analysis of Aflatoxins without Derivatization Using Ultra Performance Liquid Chromatography and Fluorescence Detection, Waters Application Note, 2019.