waters_connect™-Enabled LipidQuan™ Workflow: A Tandem Quadrupole Method for Rapid Quantification of Bioactive Lipid in Plasma

Význam tématu

Quantitativní lipidomika poskytuje klíčové informace o fyziologickém a patologickém stavu organismu prostřednictvím měření koncentrací bioaktivních lipidů v biofluidech. Rychlé, robustní a reprodukovatelné metody kvantifikace lipidů jsou nezbytné pro translaci biomarkerů do klinického výzkumu, studií expozice a farmakologie. LipidQuan představuje vysoce propustný přístup založený na HILIC separaci a tandemové kvadrupólové MS pro současné stanovení stovek lipidů v krátkém čase běhu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat získávání a vyhodnocení kvantitativních dat lipidů v plazmě za použití workflow LipidQuan s instrumenací Waters (ACQUITY Premier UPLC + Xevo TQ Absolute XR) a softwaru waters_connect pro zpracování kvantifikace. Studie popisuje přípravu vzorků, chromatografické a MS podmínky, plán akvizice MRM přechodů a způsob kalibrace s interními stabilně označenými standardy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava vzorků: proteinová precipitace plazmy (poměr 1:5) pomocí prechladlého roztoku acetonitril:isopropanol (2:1) obsahujícího interní standardní mix EquiSPLASH (200 ng/mL).
• Kalibrace: devítibodová kalibrační řada se rozsahem 0,334–167 ng/mL připravená z EquiSPLASH pro kvantifikaci příslušných tříd lipidů; regresní analýza lineární s vážením 1/x.
• Chromatografie: rychlá HILIC separace (8 minut) s akvity BEH Amide 1.7 µm, 2.1 × 100 mm; teplota kolony 45 °C, průtok 0.6 mL/min, injekce 1 µL; mobilní fáze A = 95:5 ACN/voda + 10 mM acetát amonný, B = 50:50 ACN/voda + 10 mM acetát amonný; gradient 0.1 → 20 % B v 2 min, 20 → 80 % B v 3 min, 3 min reekvilibrace.
• MS: tandemový kvadrupól v režimu MRM s ESI v pozitivním i negativním módu; plánované MRM přechody s časovým schedulingem tak, aby bylo získáno >8 bodů/vrchol.

Použitá instrumentace:

• LC: ACQUITY Premier UPLC System
• Kolona: ACQUITY BEH Amide, 1.7 µm, 2.1 × 100 mm
• MS: Xevo TQ Absolute XR Tandem Quadrupole Mass Spectrometer (StepWave XR ion guide)
• Softwarové nástroje: waters_connect Software pro akvizici a správu front, MS Quan Application (waters_connect for Quantitation) pro integraci, kalibraci a přehled dat

Hlavní analytické parametry MS (příklad): capilární napětí +2.8 kV / -1.9 kV, zdrojová teplota 120 °C, desolvace 500 °C, cone gas 150 L/hr, desolvation flow 1000 L/hr, nebulizér 7 bar. Administrativní nastavení ion guide offset uvedeno pro optimalizaci přenosu iontů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda LipidQuan umožňuje kvantifikaci více než 400 bioaktivních lipidů v jednom workflow. Konkrétně bylo v akvizici zaznamenáno 431 MRM přechodů v pozitivním módu a 446 přechodů v negativním módu; celkové nastavení LipidQuan zahrnuje až 2 041 MRM přechodů pokrývajících 16 lipidových tříd (mono-, di-, triacylglyceroly, FFA, cholesterolestery, ceramidy, hexosylceramidy, PG, PC, SM, LPC, LPE, PS, PA, PI, LPA, LPI). V experimentu byla přímo kvantifikována skupina ~239 lipidů v +ESI a ~232 lipidů v -ESI v kontrolní plazmě potkana.

Rychlá 8minutová HILIC separace poskytuje třídovou separaci podle polárních hlaviček lipidů, čímž zjednodušuje použití téhož SIL interního mixu (EquiSPLASH) pro kvantifikaci příbuzných lipidů. Časově plánované MRM (scheduling) maximalizuje dwell time a zajišťuje adekvátní počet bodů na vrchol pro robustní integraci.

Softwarová platforma waters_connect (MS Quan Application) umožnila centralizované nastavení akvizice, správu front a především přehledné zpracování dat metodou review-by-exception — rychlá kontrola kalibrací, QC a blanků pro celý dataset. Problémy s blízkým eluycí a isobarickými/isomerickými lipidy vyžadují cílenou kontrolu baseline a případné ruční úpravy integrace, což MS Quan usnadňuje pomocí grafického rozhraní pro editaci integrace.

Robustnost systému byla podpořena StepWave XR ion guide, která snižuje kontaminaci resolving kvadrupólu těžkými ionty a umožňuje stabilní akvizice velkého počtu přechodů po delší dobu. Kalibrační křivky pro reprezentativní SIL lipidy vykazovaly lineární odpověď v deklarovaném rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce propustné stanovení stovek lipidů během krátkého běhu (8 min) vhodné pro studie s velkým počtem vzorků.
• Komplexní pokrytí polarit a lipidových tříd v jednom LC-MS/MS běhu s odděleným sběrem +/− ESI dat.
• Použití SIL mixu EquiSPLASH pro třídově založenou kvantifikaci zvyšuje přesnost a komparabilitu výsledků.
• Integrované softwarové workflow (waters_connect + MS Quan) zrychluje zpracování, umožňuje review-by-exception a snižuje pracovní zátěž při prohlížení rozsáhlých datasetů.
• Robustní hardware (Xevo TQ Absolute XR se StepWave XR) zlepšuje stabilitu a provozuschopnost při dlouhodobých bězích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a aplikace zahrnují:

• Rozšíření panelů SIL standardů pro lepší absolutní kvantifikaci napříč všemi třídami lipidů a pro řešení isobarických interferencí.
• Integrace pokročilejších algoritmů pro automatizovanou kontrolu kvality a detekci špatně integrovacích špiček (machine learning, AI-driven review).
• Škálování workflow pro populacní kohortní studie a klinické projekty, včetně validace pro GLP/CLIA aplikace (pokud to regulační požadavky umožní).
• Další optimalizace chromatografie a time-schedulingu pro zvýšení počtu současně monitorovaných přechodů bez ztráty kvality dat.

Závěr

LipidQuan workflow představuje ověřenou, rychlou a robustní metodiku pro kvantifikaci stovek bioaktivních lipidů v plazmě pomocí HILIC separace a MRM akvizice na tandemovém kvadrupólu. Kombinace vhodné přípravy vzorku, SIL kalibračního mixu, časově plánovaných MRM a sofistikovaného softwarového prostředí waters_connect dovoluje efektivní získání kvantitativních dat vhodných pro translací biomarkerů a rozsáhlé studie lipidomiky.

Reference

1. Perrotti F.; et al. Advances in Lipidomics for Cancer Biomarkers Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 2016, 17, 1992. DOI: 10.3390/ijms17121992.
2. Havulinna A. S.; et al. Circulating Ceramides Predict Cardiovascular Outcomes in the Population-Based FINRISK 2002 Cohort. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2016, 36, 2424–2430. DOI: 10.1161/ATVBAHA.116.307497.
3. Munjoma N.; et al. High Throughput LC-MS Platform for Large Scale Screening of Bioactive Polar Lipids in Human Plasma and Serum. Journal of Proteome Research. 2022, 21, 2596–2608. DOI: 10.1021/acs.jproteome.2c00297.
4. Foddy H.; et al. A 30,000 Injection Assessment of Xevo TQ Absolute XR Mass Spectrometer Quantitative Stability and Uptime for Analysis of Naltrexone for Clinical Research. Waters Application Note. 2026.