Možnosti horizontálního přenosu genů antibiotické rezistence v pěstování plodin – One Health EJP FED-AMR

Význam tématu

Horizontální přenos genů rezistence k antibiotikům v agroekosystémech představuje klíčové riziko pro veřejné zdraví i produkční bezpečnost potravin. Monitoring a pochopení mechanismů šíření genů rezistence (ARG) mezi půdou, rostlinami, živočichy, odpadními vodami a volně žijící zvěří je zásadní pro řízení rizik v rámci přístupu One Health. Projekt FED-AMR (One Health EJP) zkoumal přenos ARG v konvenčním zemědělství a v experimentálních HOAL lokalitách napříč Evropou, zohlednil vliv hnojiv (kejda, hnůj, anorganická hnojiva), prvkového znečištění a přítomnost volné environmentální DNA (exDNA).

Cíle a přehled studie

Projekt měl za cíl mapovat možnosti horizontálního přenosu genů antibiotické rezistence v pěstování plodin během jednoho vegetačního období. Klíčovými otázkami byly role exDNA při mezikompartementním přenosu ARG, vliv aplikačních postupů hnojiv na rozložení kovů a ARG, a detekce rezistentních patogenů v prostředí. Studie zahrnovala více pracovních skupin v 44 partnerských institucích a heterogenní geografické pokrytí (Sever, Jih, Východ, Západ Evropy).

Použitá metodika

Analytický přístup byl multioborový a kombinoval kultivační a nekultivační metody, molekulární techniky, sekvenační přístupy a chemické analýzy:

• Kultivace cílových druhů: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis/faecium, MRSA, Salmonella spp., klostridia.
• Identifikace a fenotypizace: MALDI-TOF, testy citlivosti na antibiotika.
• Genomika a metagenomika: sekvenace genomů izolátů a komplexní metagenomické analýzy pro detekci ARG (databáze MEGARes 2.0, ACLAME; ARESGenetics analýzy).
• qPCR a cílené panely: kvantifikace specifických ARG pro porovnání s metagenomikou; ARESupa panel (>9000 markerů) pro kulturami nezávislou analýzu rezistomu.
• Analýzy volné environmentální DNA (exDNA): sledování historické biodiverzity a potenciálu exDNA pro přenos ARG.
• Prvková analýza kovů a metaloidů: multivariační statistika koncentrací kovů (Cu, Zn, Mn aj.) k posouzení dopadu hnůjů/kejdy a hnojiv.
• Analýza antimikrobiálních látek: UHPLC-MS/MS (vyvinutá metoda pro 29 látek) pro detekci reziduí ATB v půdě a vodě; detekováno doxycyklinové ATB v prostředí s aplikací kejdy/hnůj.

Použitá instrumentace

Hlavní přístrojové a analytické platformy zahrnovaly:

• MALDI-TOF pro rychlou identifikaci bakteriálních izolátů.
• Illumina/sekvenční platformy pro genomiku a metagenomiku (vč. genomového obohacení).
• qPCR systémy pro kvantitativní detekci vybraných ARG.
• UHPLC-MS/MS pro analýzu antimikrobiálních látek v půdách a vodách.
• Spektrometrie/ICP pro prvkovou analýzu kovů a metaloidů.
• Bioinformatické nástroje a databáze: MEGARes 2.0, ACLAME, ARESGenetics, ARESupa; vlastní repares databáze pro odpadní vody.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní empirické nálezy projektu FED-AMR lze shrnout následovně:

• Vzorkování a detekce: Celkem 475 environmentálních vzorků obsahovalo 7 252 detekovaných genů rezistence, z toho 89 klinicky relevantních genů spojených s E. coli, E. faecalis, K. pneumoniae a E. faecium; významný podíl pocházel z kompartmentu volně žijící zvěře a z odpadních vod.
• Prevalence a distribuce ARG: 33 % izolátů neslo alespoň jeden gen rezistence. Průměrný počet ARG na izolát byl u E. coli ~48,6, u K. pneumoniae ~20,6, u E. faecium 3,3 a u E. faecalis 2,4. Nejčastěji detekovaným genem byl tetW (přítomen ve 343 vzorcích).
• Spectrum rezistence v prostředí wildlife: detekovány geny rezistence vůči 30 třídám antibiotik; nejvíce zastoupeny byly β-laktamy, tetracykliny, aminoglykosidy a fluorochinolony. Zjištěna byla i rezistence k těžkým kovům s pořadím Cu > Hg > As > Ni-Co > Cr > Ag.
• Prvková analýza: koncentrace Cu, Zn a Mn se ukázaly jako citlivé indikátory dopadu kejdy/hnůj; v některých vzorcích byly překročeny minimální ko-selektivní koncentrace (MCC) mědi a zinku, což může podporovat selekci rezistence.
• Rezidua antimikrobik: zjištěn byl prakticky jen doxycyklin v několika vzorcích (8 vzorků) z polí s aplikací prasečí kejdy a kravského hnoje, což naznačuje, že přítomnost reziduí ATB v prostředí může být lokální a závisí na aplikačních praktikách.
• Metodologická komparace: metagenomické sekvenování poskytlo široký přehled rezistomu, avšak v některých případech detekovalo méně ARG než cílené qPCR metody, což podtrhuje nutnost kombinace metod. Metoda ARESupa nabídla široké pokrytí markerů (>9000).
• Role exDNA: exDNA tvořila významnou složku environmentálních vzorků (až ~55 % signálu), což potvrzuje hypotézu o možnosti přenosu genetické informace přes kompartementy prostředí a její potenciální roli v historické biodiverzitě rezistomu.

Limity studie zahrnovaly krátké časové rozmezí (jedno vegetační období považováno za příliš krátké pro plné posouzení dynamiky), omezení financí a lidských zdrojů pro hluboké sekvenování (hloubka ~6–7 Gb považována za nedostatečnou; doporučeno ≥2 Tb pro komplexní rozbor), a variabilitu mezi laboratořemi, která ztěžuje integraci dat do jedné komplexní syntézy.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledky projektu poskytují praktické výstupy pro řízení rizik a pro regulační i zemědělské praxe:

• Identifikace klíčových indikátorů znečištění (Cu, Zn, Mn) umožňuje cíleně sledovat dopady aplikací kejdy/hnůj a optimalizovat management hnojiv.
• Integrace kultivačních, qPCR a metagenomických přístupů zvyšuje spolehlivost diagnostiky rezistomu v prostředí a doporučuje kombinované sledování v monitorovacích programech.
• Detekce exDNA jako významného zdroje genetické informace naznačuje potřebu zahrnout tuto složku do hodnocení přenositelnosti ARG.
• Identifikované rizikové zdroje (odpadní vody, wildlife) umožňují cílené intervence a prioritizaci kontrolních opatření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Na základě zkušeností z FED-AMR lze doporučit následující směry dalšího výzkumu a aplikačního nasazení:

• Dlouhodobé (víceleté) sledování pro zachycení sezónnosti a kumulativních efektů aplikací hnojiv.
• Zvýšení hloubky sekvenování a rozvoj bioinformatických kapacit pro robustní metagenomické analýzy a integraci velkých datových sad.
• Standardizace protokolů vzorkování a analytických postupů napříč laboratořemi s cílem zvýšit srovnatelnost výsledků.
• Zavedení cíleného monitoringu exDNA a validace její role v přenosu ARG pomocí transformačních studií s kompetentními mikroby.
• Rozvoj indikátorových panelů (kombinace chemických markerů kovů a molekulárních markerů ARG) pro rutinní monitoring v zemědělství a okrajových ekosystémech.
• Potřeba post-projektového financování a zapojení stakeholderů pro udržitelnost výsledků a implementaci doporučení do praxe.

Závěr

Projekt FED-AMR přinesl komplexní, víceoborový pohled na problematiku horizontálního přenosu genů antibiotické rezistence v agroekosystémech. Klíčová zjištění zahrnují význam volné exDNA, roli odpadních vod a volně žijící zvěře jako rezervoárů klinicky relevantních ARG, a vliv kovů (zejména Cu, Zn) spojený s aplikací kejdy/hnůj na selekci rezistence. Studie poukázala také na metodologická omezení (sekvenační hloubka, finanční a personální kapacity) a potřebu kombinace analytických přístupů. Pro praktické řízení rizik jsou doporučena cílená monitorovací schémata, standardizace metod a prodloužené časové studie.

Reference

1. Gardner B, Betson M, Cabal Rosel A, et al. Mapping the evidence of the effects of environmental factors on the prevalence of antibiotic resistance in the non-built environment: Protocol for a systematic evidence map. Environ Int. 2023;171:107707. doi:10.1016/j.envint.2022.107707.
2. Cabal A, Peischl N, Rab G, Stöger A, Springer B, Sucher J, Allerberger F, Ruppitsch W. Draft Genome Sequence of a Multidrug-Resistant Escherichia coli Sequence Type 1193 Pandemic Clone Isolated from Wastewater in Austria. Microbiol Resour Announc. 2021. doi:10.1128/mra.00762-21.
3. Coelho RG, Manageiro VMMG, Dias DMA. Characterization of antibiotic resistance in strains isolated from different environmental reservoirs. Master Thesis. 2023. doi:10.5281/zenodo.7584902.
4. Cabal A, Rab G, Daza-Prieto B, et al. Characterizing Antimicrobial Resistance in Clinically Relevant Bacteria Isolated at the Human/Animal/Environment Interface Using Whole-Genome Sequencing in Austria. Int J Mol Sci. 2022;23(19):11276. doi:10.3390/ijms231911276.
5. Felipe-Sotelo M, Brandtner M, Ward NI, et al. Impact of manure and artificial fertilizer application on metal and metalloid distributions in agricultural soils and crops. Chemosphere. 2025;375:144243. doi:10.1016/j.chemosphere.2025.144243.
6. Gbylik-Sikorska M, Gajda A, Felipe-Sotelo M, et al. Investigation of 29 Antimicrobial Compounds in Soil Using Newly Developed UHPLC-MS/MS Method. Molecules. 2023;28(18):6496. doi:10.3390/molecules28186496.