A New Lipid Software Workflow for Processing Orbitrap-based Global Lipidomics Data in Translational and Systems Biology Research

Význam tématu

Analýza lipidomu pomocí vysokorozlišující LC–MS/MS je klíčová pro translational a systems biology výzkum, protože lipidy tvoří rozsáhlou, chemicky rozmanitou skupinu sloučenin s mnoha izomerickými a isobarickými formami. Spolehlivá identifikace a kvantifikace lipidů je nezbytná pro zjišťování fenotypových změn, biomarkerů a porozumění metabolickým drahám v modelech nemocí a buněčných mutacích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo představit a ověřit nový softwarový workflow založený na MS2 vyhledávání (Lipid Search, MKI) pro zpracování dat z Orbitrap vysokorozlišujících přístrojů. Studie porovnávala výsledky lipidomiky získané LC–MS/MS workflow s výsledky infusion (shotgun) lipidomiky a s tradiční metabolomickou analýzou založenou pouze na přesné hmotnosti. Modelovým systémem byly mitochondrie ze dvou kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae: divoký typ (WT) a knockout (KO) s defektem v produkci koenzymu Q (CoQ).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek a příprava:

• Mitochondrie obohacené z kvasinek pomocí zymolázy a diferenciální centrifugace; protein ~0,25 mg na vzorek.
• Extrahováno třikrát 400 µL isopropanolu při 4 °C, vysušeno a rozpuštěno v 65:35:5 acetonitril:isopropanol:voda obsahujícím interní standard 17:0 PG.

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• Thermo Scientific Accela 1250 chromatograf s Accela Open autosampler, injekce 10 µL.
• Kolona: C18, 2.1 × 100 mm, 2.7 µm; průtok 260 µL/min, teplota 55 °C; RP gradient vhodný pro separaci metabolitů i lipidových tříd.
• Detektor: Thermo Scientific Q Exactive Orbitrap; full-scan ESI+ při 70 000 rozlišení, Top5 datově řízené MS/MS při 35 000 rozlišení, kolizní energie (CE) ~35.

Softwarové zpracování:

• Identifikace a zpracování lipidů pomocí Lipid Search (MKI) – MS2 založené vyhledávání v rozsáhlé databázi (řečeno >10^6 predikovaných lipidů/konfigurací).
• Komparativní metabolomická analýza pomocí Thermo SIEVE (accurate-mass MW search) pro srovnání přístupů.
• Parametry vyhledávání: hmotnostní tolerance přecursoru ~5 ppm, fragmentů ~10 ppm; alinace napříč vzorky s retenční tolerancí ~0.25 min; kvantifikace z extrahovaných iontových chromatogramů (EICh) a integrace ploch.

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace a statistika:

• Lipid Search analyzoval LC–MS/MS data rychle (výsledky v řádu minut na běžném laptopu) a identifikoval 380 lipidových druhů z mitochondriálních extraktů.
• Zjištěno 112 lipidů se statisticky významnou změnou mezi KO a WT (t-test, p < 0.05).
• PCA a diskriminační statistiky potvrdily odlišný fenotyp KO (např. změny v profilech CoQ a v řadě glycerofosfolipidů a sacharidových lipidů).

Porovnání přístupů:

• MS2-řízené vyhledávání v rozsáhlé databázi prokázalo vyšší spolehlivost při identifikaci lipidů v komplexních extraktech než přístupy založené pouze na přesné hmotnosti (MW search), které jsou náchylné k chybné přiřazení kvůli izobarům/izomerům.
• Lipid Search dokázal rozlišit směsi produktních iontů a přiřadit převládající komponentu, čímž snižuje falešné pozitivní shody a zvyšuje důvěru při anotaci molekul.

Praktická poznámka:

• Workflow zahrnuje kroky: detekce peaků (full-scan + MS/MS), identifikace MS2 proti DB, alignace mezi běhy, kvantifikace EICh a statistické vyhodnocení (t-testy, heatmapy, whisker grafy).

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená přesnost identifikací lipidů v komplexních biologických vzorcích díky MS2 databázovému přístupu.
• Rychlé zpracování dat vhodné pro vysokopropustné studie a integraci do translational research a systémové biologie.
• Možnost zpracování LC–MS/MS dat i v přítomnosti izobarických směsí a rozlišení tříd lipidů podle retenčního času a fragmentačních vzorů.
• Užitečné pro biomarker discovery, fenotypování genetických mutací (např. defekty v biosyntéze CoQ) a pro QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace s rozsáhlými lipidovými databázemi a veřejnými repozitáři pro lepší anotaci méně běžných lipidů.
• Rozšíření workflow o kvantitativní standardy, izotopově značené interní standardy a kalibrační křivky pro absolutní kvantifikaci.
• Využití MSn (hloubkové fragmentace), iontové mobility a vyšších rychlostí akvizice pro lepší rozlišení isomerů a konformací.
• Automatizace zpracování, integrace s bioinformatickými nástroji pro pathway analýzu a nasazení v klinických studiích pro identifikaci lipidových biomarkerů.

Závěr

MS2 založený workflow s Lipid Search v kombinaci s vysokorozlišujícím Orbitrap LC–MS/MS poskytuje rychlý, citlivý a spolehlivý způsob komplexní lipidomické analýzy. Prokázal lepší výkonnost proti tradičním přesnohmotnostním přístupům v identifikaci lipidů v komplexních mitochondriálních extraktech a umožnil rychlou identifikaci stovek lipidů a desítek statisticky významných rozdílů mezi fenotypy WT a KO. Metoda je vhodná pro translational research, objev biomarkerů a systematické studie lipidových změn.

Reference

1. Peake DA, et al. Quantitative yeast lipidomics via LC-MS profiling using the Q Exactive Orbitrap mass spectrometer. LIPID MAPS Annual Meeting, 2012.
2. Fahy E, et al. LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. J. Lipid Res. 2009, 50, S9–S14.
3. Taguchi R, et al. Precise and global identification of phospholipid molecular species by an Orbitrap mass spectrometer and automated search engine Lipid Search. J. Chrom. A, 2010, 1217, 4229–4239.
4. Yamada T, et al. Development of a lipid profiling system using reverse-phase LC coupled to high-resolution MS with rapid polarity switching and automated lipid identification. J. Chrom. A, 2013, 1292, 211–218.
5. Ejsing CE, et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106, 17981–17986.