Analysis of Creatine and Creatinine in Dietary Supplements Using HILIC-MS

Význam tématu

Analýza kreatinu a jeho degradovaného produktu kreatininu v potravinových doplňcích je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a shody označení výrobků. Kreatin je široce užívaný sportovní a výživový doplněk; kontrola tvorby kreatininu během výroby a skladování pomáhá zachovat deklarované množství aktivní látky a minimalizovat nežádoucí degradaci. Metody kompatibilní s hmotnostní spektrometrií (MS) zvyšují selektivitu a citlivost měření v komplexních matricích doplňků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikované poznámky byla vývoj a demonstrace HILIC-MS metody pro kvantifikaci kreatinu a kreatininu v komerčních potravinových doplňcích. Studie ověřila vhodnost hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) pro retenci polarizovaných analytů, optimalizovala výběr stacionární fáze a ukázala, že metoda poskytuje linearitu a přesnost dostačující pro kontrolu obsahu kreatinu a sledování tvorby kreatininu v reálných vzorcích.

Použitá metodika

Vzorky: tři komerční produkty — dva práškové (jeden „čistý“ kreatin monohydrát, druhý s přísadami) a jeden tabletový přípravek obsahující kreatin plus aminokyseliny a dochucovadla. Standardy: zásobní roztoky kreatinu a kreatininu 2 mg/mL ve vodě; kalibrační řada připravená 1–200 µg/mL v 95:5 acetonitril:voda (v:v) s bracketovanými trojitými injekcemi (n = 6 na hladinu). Příprava vzorků: rozpuštění ekvivalentu 5 g kreatinu v 500 mL vody u prášků a extrakce tablet v 90:10 acetonitril:voda s vortexem, sonikací, filtrací a následným ředěním do nominálních 10 µg/mL (kreatin).

Použitá instrumentace

HPLC/MS systém a komponenty využité v práci zahrnovaly následující přístroje a kolony:

• ACQUITY UPLC H-Class Plus System s Column Manager a ACQUITY UPLC PDA detektorem
• ACQUITY QDa Mass Detector (MS detekce)
• ACQUITY Premier BEH HILIC Column, 2.1 × 50 mm, 1.7 µm (vybraná pro finální metodu)
• Alternativně testované kolony: ACQUITY Premier BEH Amide Column a Atlantis Premier BEH Z‑HILIC Column
• Mobilní fáze: acetonitril (organická složka), voda, doplňkově 200 mM ammonium formiát pH 3.0 jako zásobník
• Teplota kolony 30 °C, objem injekce 1.0 µL, průtok 0.4 mL/min, vzorky uloženy při 10 °C
• Data management: Empower Chromatography Data System (CDS)

Hlavní výsledky a diskuse

- Výběr stacionární fáze: ze tří testovaných HILIC materiálů (BEH HILIC, BEH Amide, Z‑HILIC) poskytl BEH HILIC nejlepší kombinaci tvaru píku a intenzity signálu pro kreatin a dostatečnou retenci těchto polárních látek. Různé mechanismy retence (partitioning, ion‑exchange, hydrogen bonding) vedly u ostatních fází k širším nebo menšímu signálu u kreatinu.

- Lineární rozsah a přesnost: pro oba analyty byla získána lineární odpověď v rozsahu 1–200 µg/mL s R2 = 0,998 pro kreatin a R2 = 0,995 pro kreatinin. Vypočtené koncentrace kreatinu v analyzovaných vzorcích se shodovaly s nominální hodnotou 10 µg/mL v rozmezí do 8 %, což indikuje dobrou přesnost metody pro kvantifikaci kreatinu.

- Detekce kreatininu: úrovně kreatininu v ředěných vzorcích byly velmi nízké; v jednom prášku (Powder A) nebyl kreatinin detekován, zatímco Powder B a tabletový vzorek obsahovaly měřitelné, ale nízké hladiny. Analýza zásobních (nerozředěných) roztoků ukázala vyšší hladiny kreatininu dobře v rozsahu kalibrace, což naznačuje, že ředění a matrix mohou skrývat nebo snižovat měřitelnou koncentraci při běžné analytické rutinní přípravě.

- Interference a separace: metoda zajistila dostatečné rozlišení kreatinu a kreatininu od většiny přítomných složek (aminokyseliny, dochucovadla). Výjimkou byla částečná koeluce kyseliny jablečné s kreatinem, avšak odlišení bylo možné díky rozdílné ionizaci (malát detekovatelný v ESI‑, kreatin v ESI+). Celkově MS detekce umožnila selektivní detekci i v přítomnosti souběžně přítomných matricových komponent.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda eliminuje potřebu nevolatilních pufrů nebo ion‑pair činidel, čímž je plně kompatibilní s MS detekcí.
• HILIC poskytuje silnou retenci pro velmi polární analyty, jako je kreatin/kreatinin, které jsou problémové v běžném RP režimu.
• Vysoká selektivita MS umožňuje identifikovat a oddělit vedlejší složky, což usnadňuje charakterizaci formulovaných produktů a detekci degradace.
• Pro rutinní kontroly kvality (QA/QC) je metoda vhodná pro ověření deklarovaného obsahu kreatinu a sledování tvorby kreatininu během výroby a skladování.

Omezení a doporučení

• Nízké hladiny kreatininu v ředěných vzorcích mohou klesnout pod detekční nebo kvantifikační hranici — pro spolehlivou kvantifikaci kreatininu se doporučuje analýza méně naředěných stock roztoků nebo použití koncentračních kroků.
• Matricové efekty (přítomnost organických kyselin, aminokyselin, dochucovadel) mohou ovlivnit tvorbu nebo detekci kreatininu; doporučená je validace metody v reálných matricích a případné použití interních standardů.
• V práci byla pro některé výpočty využita jednorázová injekce (kreatinin ve stocku), proto jsou výsledky pro kreatinin v těchto případech indikativní a vyžadují replikaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvýšení citlivosti a spolehlivosti: zavedení izotopově značených interních standardů pro kreatin a kreatinin zlepší kvantifikaci a kompenzaci matricových efektů.
• Rozšíření panelu analyzovaných látek: metoda HILIC‑MS může být rozšířena na současné stanovení dalších vysoce polárních metabolitů nebo aminokyselin v doplňcích.
• Automatizace a rutinní validace: validace podle norem pro laboratorní QA/QC a automatizace přípravy vzorků posílí použitelnost v průmyslových a regulačních laboratořích.
• Stability studies: využití metody ke sledování časové stability kreatinu v různých formulacích a podmínkách skladování za účelem minimalizace tvorby kreatininu.
• Vývoj citlivějších HILIC stacionárních fází a adaptace pro vysoce přesné kvantitativní studie napomohou lepší identifikaci i stopových degradantů.

Závěr

HILIC‑MS s použitím ACQUITY Premier BEH HILIC kolony představuje efektivní přístup pro kvantifikaci kreatinu a monitorování kreatininu v doplňcích stravy. Metoda dosahuje dobré linearity a přesnosti pro kreatin v rozsahu 1–200 µg/mL a poskytuje dostatečnou selektivitu k oddělení analyzovaných látek od běžných pomocných složek vzorců. Pro konzistentní stanovení nízkých hladin kreatininu se doporučuje minimalizovat nadměrná ředění, použít interní standardy a provést robustní validační studie v konkrétních matricích.

Reference

1. Clark J.F. Creatine and phosphocreatine: a review of their use in exercise and sport. J. Athl. Train. 1997;32:45–51.
2. Brosnan J., Brosnan M. Creatine: Endogenous Metabolite, Dietary, and Therapeutic Supplement. Annu. Rev. Nutr. 2007;27:241–261.
3. Beal M.F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 2011;40:1305–1313.
4. Wyss M., Kaddurah‑Daouk R. Creatine and Creatinine Metabolism. Physiol. Rev. 2000;80(3):1107–1213.
5. Saiki P., Sales G.M., de Oliveira A., Catharino R. Multi‑analytical characterization of creatine degradation for dietary supplement safety assessment. Food Res. Int. 2025;221:117472.
6. Kashani K., Rosner M.H., Ostermann M. Creatinine: From physiology to clinical application. Eur. J. Intern. Med. 2020;72:9–14.
7. Moret S., Prevarin A., Tubaro F. Levels of creatine, organic contaminants and heavy metals in creatine dietary supplements. Food Chem. 2011;126:1232–1238.
8. Dunnett M., Harris R.C., Orme C.E. Reverse‑phase ion‑pairing HPLC on phosphocreatine, creatine, and creatinine in equine muscle. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1991;51:137–141.
9. Guo Y., Muscatiello D. An update on the progress in fundamental understanding of hydrophilic interaction liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 2026;1765:466520.
10. Guo Y., Baran D., Ryan L. Quantitative Assessment of Retention Mechanisms for Ionized Compounds in Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC). Anal. Chem. 2025;97(7):4057–4065.
11. Buszewski B., Noga S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) – a powerful separation technique. Anal. Bioanal. Chem. 2012;402:231–247.
12. Periat A., Boccard J., Veuthey J.L., Rudaz S., Guillarme D. Systematic comparison of sensitivity between HILIC and RP LC coupled with MS. J. Chromatogr. A. 2013;1312:49–57.
13. Berthelette K., Kalwood J., Haynes K. Development and Optimization of a HILIC‑MS Separation of 17 Amino Acids Using an XBridge Premier BEH Amide Column. Waters Application Note. 2023.
14. Walter T.H. Advances in Chromatography Vol. 60, Recent Advances in HPLC and SFC Columns Packed with Hybrid Organic/Inorganic Particles. CRC Press. 2024;44–78.
15. Walter T.H., et al. Characterization of a highly stable zwitterionic HILIC stationary phase based on hybrid particles. J. Sep. Sci. 2022;45:1389–1399.
16. Gilar M., Berthelette K., Walter T.H. Contribution of ionic interactions to stationary phase selectivity in HILIC. J. Sep. Sci. 2022;45(17):3264–3275.
17. Guo Y., Bhalodia H., Fattal B., Serris I. Evaluating the adsorbed water layer on polar stationary phases for HILIC. Separations. 2019;6:19–28.