The Quantification of Glucagon-like Peptide Receptor Agonists (GLP-1 RAs) in Plasma Extracts Using Capillary UHPLC-MS/MS

Kvantifikace GLP‑1 receptorových agonistů (GLP‑1 RAs) v plasmě metodou kapilární UHPLC‑MS/MS — souhrn aplikace

Význam tématu

Obezita a s ní spojené metabolické choroby představují významnou globální zátěž a vyžadují nové, vysoce účinné léčebné přístupy. Agonisté GLP‑1 (a hybridní GIP/GLP‑1 látky jako tirzepatid) vykazují dlouhý biologický poločas a nízké plazmatické koncentrace v eliminační fázi, což klade vysoké nároky na citlivost bioanalytických metod používaných v DMPK a klinických PK studiích. Zvýšení analytické citlivosti při současném zachování robustness a průchodnosti laboratorních sérií je proto zásadní.

Cíle a přehled studie

Cílem popsaného řešení bylo zvýšit citlivost kvantifikace GLP‑1 RAs v lidských plazmatických extraktech bez složité optimalizace nanospraye a bez prodloužení doby analýzy. Konkrétně byla demonstrována možnost až 10× zvýšení detekční citlivosti pro semaglutid a tirzepatid použitím kapilární (300 µm ID) UHPLC spojené s tandemovou kvadrupólovou MS v režimu MRM, přičemž byla ověřena robustnost systému pro >500 injekcí a výrazné snížení spotřeby elučních rozpouštědel.

Použitá metodika

Vzorky: calibrátory a testovací roztoky peptidů (liraglutid, exenatid, semaglutid, tirzepatid) připraveny v lidské plasmě. Plazmatické extrakty byly připraveny dvěma přístupy:

• SPE µElution (Oasis MAX): 50 µL plazmy, proteinová precipitace methanolem (2:1), extrakt aplikován na kondicionované µElution sorbenty, eluován vodou/ACN s 5 % kyselinou mravenčí, následně ředěn 1:1 vodou s 0,1 % plazmy.
• Proteinová precipitace: 50 µL plazmy + 100 µL ACN, centrifugace, supernatant ředěn 1:1 vodou (0,1 % plazmy).

Chromatografie a injektování:

• Kapilární analytická kolona: ACQUITY Premier Peptide CSH C18, 300 Å, 1.7 µm, 300 µm × 50 mm, teplota 65 °C, průtok 15 µL/min.
• Gradient: A = 0.1 % FA ve vodě, B = 0.1 % FA v ACN; počáteční hold 0.5 min, 20→80 % B během 3 nebo 10 min, průplach 95 % B, re‑equilibrace.
• Velkokapacitní naložení provedeno on‑line s krátkou trapping kolonkou (300 µm × 20 mm Symmetry C18, 5 µm) umístěnou na 6‑port TVM: 10 µL naloženo při 20 µL/min v 0.1 % FA po 2 minutách, poté přepojeno a eluováno analytickou kolonkou při 15 µL/min.

Hmotnostní spektrometrie:

• MRM v pozitivním ESI, jednotkové rozlišení; kapilární napětí 3.0 kV, cone voltage 32 V, cone gas 50 L/h, desolvation gas 300 L/h při 600 °C.
• Sledované MRM přechody: liraglutid 938.7 → 1128.4; exenatid 838 → 396; semaglutid 1029.2 → 1238.1; tirzepatid 1204.2 → 396.2.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC M‑Class (kapilární konfigurace) s TVM (Trap Valve Manager) pro in‑line trapping.
• Xevo TQ‑XS triple quadrupole se speciálním mikroflow ESI pro nízké průtoky.
• Analytické a trapping kolony: ACQUITY Premier Peptide CSH C18 (300 µm × 50 mm) a Symmetry C18 trapping (300 µm × 20–25 mm).
• Softwarové prostředí pro zpracování: waters_connect a MS Quan (quantitation workflow, 21 CFR Part 11 kompatibilita pro waters_connect).

Hlavní výsledky a diskuse

- Chromatografie: Peptidy elutovaly v pořadí semaglutid, liraglutid, exenatid, tirzepatid s retenčními časy ~4.5–5.4 min; základní šířky píků 6–7.5 s, dosažená kapacita separace 82–99 pro 10 min gradient (vyšší než typická analytická 2.1 mm konfigurace ≈60).

- Citlivost: Při 1 µL naložení se intenzita signálu semaglutidu vzrostla z ~2.5e4 (2.1 mm) na ~1.96e5 (300 µm), pro tirzepatid z ~8e3 na ~1.24e5 — tedy ~8–14× nárůst v peak response při kapilárním režimu. Celkově autoři uvádějí až 10× zlepšení detekční citlivosti proti standardní 2.1 mm UHPLC‑MS/MS.

- Nízké meze detekce: Použití in‑line trapu k umožnění velkých injektovaných objemů vedlo k LLD pro tirzepatid až 20 pg/mL (SPE extrakty) a 50 pg/mL (protein precipitace); dynamické rozsahy pro kvantifikaci pokrývaly nízké desítky pg/mL až stovky až tisíce pg/mL v závislosti na přípravě vzorku.

- Robustnost: Metoda byla ověřena při >500 injekcích (5× batch po 100 vzorcích) bez mezi‑batch čištění; %CV intenzit po odstranění blanků se pohyboval mezi 4.7 % (tirzepatid) a 20.1 % (liraglutid), bez znatelných změn chromatografického výkonu nebo zvýšení back‑pressure.

- Ekonomika provozu: Snížení průtoku ze standardních 400 µL/min na 15 µL/min znamená přibližně 26× snížení spotřeby rozpouštědel oproti běžnému 2.1 mm UHPLC, což snižuje náklady i množství odpadu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zlepšení citlivosti bez nutnosti složité nanospray konfigurace, což usnadňuje zavedení do rutinních bioanalytických laboratoří.
• Možnost kvantifikovat dlouhodobě působící peptidové léčiva v eliminační fázi při koncentracích v řádu desítek pg/mL — důležité pro přesné vymezení PK křivek a odvození parametrů jako t½ a clearance.
• Kompatibilita s vyšším průchodem vzorků díky robustnosti kolon a možnosti automatizovaného naložení s in‑line trapem.
• Snížení provozních nákladů díky nižší spotřebě organických rozpouštědel.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Aplikace kapilární UHPLC‑MS/MS pro další bioterapeutické látky (oligonukleotidy, peptidové konjugáty) a farmakokinetiku při nízkých dávkách či mikro‑odběrech.
• Další integrace s automatizovanými vzorkovacími systémy a s LIMS pro zvýšení throughputu a traceability.
• Optimalizace trap‑a‑elute strategií pro ještě vyšší naložení a redukci matrix efektů; kombinace s orthogonalními čistícími kroky pro zvýšení selektivity.
• Vývoj softwarových nástrojů pro robustní kvantitativní workflow a validaci metod na úrovni GLP/GCP.

Závěr

Autoři demonstrovali, že kapilární UHPLC (300 µm ID) v kombinaci s triple quadrupole MS a in‑line trappingem poskytuje jednoduchou, robustní a vysoce citlivou platformu pro kvantifikaci GLP‑1 RAs v lidské plasmě. Metoda dosahuje limitů detekce až v desítkách pg/mL, udržuje stabilní výkon při stovkách analýz a současně snižuje spotřebu rozpouštědel. To představuje praktickou alternativu k nanospray přístupům pro farmakokinetické a bioanalytické aplikace zaměřené na moderní, vysoce účinné bioterapeutika.

Reference

1. Drucker DJ. GLP‑1‑based therapies for diabetes, obesity and beyond. Nat Rev Drug Discov. 2025;24:631–650.
2. Müller TD, Blüher M, Tschöp MH, DiMarchi RD. Anti‑obesity drug discovery: advances and challenges. Nat Rev Drug Discov. 2022;21:201–223.
3. Overgaard RV, et al. Population Pharmacokinetics of Semaglutide for Type 2 Diabetes. Diabetes Ther. 2019;10:649–662.
4. Lee TS, et al. Novel LC‑MS/MS analysis of the GLP‑1 analog semaglutide with its application to pharmacokinetics and brain distribution studies in rats. J Chromatogr B. 2023;1221:123688.
5. Vissers JP, Blackburn RK, Moseley MA. A novel interface for variable flow nanoscale LC/MS/MS for improved proteome coverage. J Am Soc Mass Spectrom. 2002;13(7):760–771.
6. Edwards JL, Edwards RL, Reid KR, Kennedy RT. Effect of decreasing column inner diameter and use of off‑line two‑dimensional chromatography on metabolite detection in complex mixtures. J Chromatogr A. 2007;1172(2):127–134.
7. Trudeau M, Scumaci A. SPE‑LC/MS Bioanalytical Quantification of the Biotherapeutic Peptide, Semaglutide From Plasma. Waters application note. 2023.
8. Plumb RS, et al. The application of fast gradient capillary liquid chromatography/mass spectrometry to the analysis of pharmaceuticals in biofluids. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(10):865–872.
9. Plumb RS, Warwick H, Higton D, Dear GJ, Mallett DN. Determination of 4‑hydroxytamoxifen in mouse plasma in the pg/mL range by gradient capillary LC/MS/MS. Rapid Commun Mass Spectrom. 2001;15(4):297–303.
10. Jiang D, Yuan L. Microflow LC–MS/MS to improve sensitivity for antisense oligonucleotides bioanalysis: critical role of sample cleanness. Bioanalysis. 2022;14(21):1365–1376.