Streamlining Analytical Method Development for NDSRIs and Mutagenic Impurities in Pharmaceutical Formulations Using Single-Quadrupole LC-MS

Význam tématu

Kontrola nitrosaminů v léčivých přípravcích je v současnosti prioritou regulačních orgánů (FDA, EMA) kvůli jejich karcinogennímu riziku. Nitrosamine drug substance-related impurities (NDSRI) vznikají nitrosací API nebo souvisejících nečistot a často mají strukturální podobnost s API, takže jejich toxicita je variabilní. Praxe vyžaduje citlivé, selektivní a efektivní analytické metody pro screening a kvantifikaci NDSRI a současně i mutagenních nečistot podle doporučených AI (acceptable intake) limitů. Tento článek popisuje postup rychlého vývoje LC podmínek pomocí softwaru LabSolutions MD a následné citlivé stanovení pomocí single‑kvadrupólového LC‑MS (LCMS‑2050) na modelovém příkladu atenololu a jeho potenciálních nečistot.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ukázat, že kombinace automatizovaného softwarového workflow pro vývoj LC metod a moderního single‑kvadrupólového LC‑MS umožňuje:

• rychlou optimalizaci mobilních fází, kolon a gradientů pro separaci API, NDSRI a mutagenních nečistot,
• kvantifikaci N‑nitrosoatenololu (NDSRI) a atenolol impurity D (mutagenní nečistota) v API a v tabletových formulacích na úrovních relevantních vůči AI limitům,
• současný screening obou typů nečistot s dostatečnou citlivostí a opakovatelností.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika kombinuje systematický vývoj LC podmínek v LabSolutions MD s kvantitativní analýzou na LCMS‑2050 v režimu SIM. Sledoval se model atenolol (API), N‑nitrosoatenolol (NDSRI) a atenolol impurity D (mutagenická nečistota). Klíčové body:

• Vyhodnoceny byly dvě kolony: Shim‑pack Velox SP‑C18 (50×2.1 mm, 2.7 µm) a Shim‑pack Scepter C18‑120 (50×2.1 mm, 3 µm).
• Testovány mobilní fáze A: 5 mM ammonium formate, 5 mM ammonium acetate, 0.1 % formic acid, H2O; B: methanol a acetonitril.
• Automatizovaná evaluace kombinací kolona/mobilní fáze a generování matic podmínek v LabSolutions MD s vizualizací rozlišení a citlivosti.
• Optimalizace gradientu zahrnovala systémové změny počátečního %B, doby zdržení a sklonu gradientu; použit byl také AI‑prediktor chromatogramů a optimalizace pro maximální rozlišení.
• Finální LC podmínky: Nexera X3, Shim‑pack Velox SP‑C18, teplota 40 °C, inj. objem 1 µL, mobilní fáze A = 5 mM ammonium formate ve vodě, B = methanol, průtok 0,4 mL/min, časový program ~20 % B (0–2.00 min) → 99 % B (5.00–7.00 min) → 20 % B (7.01–10.00 min); tok směrem do odpadu 0–1.5 min.
• MS parametry (shrnutí): LCMS‑2050, DUIS, pozitivní ionizace i SIM módy; SIM m/z: atenolol 267.17, N‑nitrosoatenolol 296.16, atenolol impurity D 244.07. Typické provozní parametry: DL 250 °C, desolvace 500 °C, rozmezí skenu +/- 100–1000 m/z. (V textu jsou uvedena přesná nastavení plynů a napětí pro reprodukovatelnost.)
• Příprava vzorků: API – methanolická extrakce; tablety – receptura: rozdrcení, 215 mg prášku (ekvivalent 50 mg API) extrahováno 75 mL methanolu, 15 min, centrifugace 10 000×g 1 min při 4 °C, supernatant k LC‑MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Vývoj LC podmínek

• LabSolutions MD urychlil screening kolon, mobilních fází a gradientů pomocí hromadné analýzy a maticového zobrazení chromatogramů; optimální kombinací byla Shim‑pack Velox SP‑C18 s A = 5 mM ammonium formate a B = methanol z hlediska citlivosti a rozlišení.
• AI‑asistovaná predikce chromatogramu usnadnila nalezení gradientu, který zvýšil separaci N‑nitrosoatenololu od atenolol impurity D.

Kvalita analytiky a limity

• Kalibrační křivky: N‑nitrosoatenolol splňoval přesnost 80–120 % v rozsahu 0.2–200 ng/mL; atenolol impurity D splňoval stejná kritéria v rozsahu 2–200 ng/mL. Koeficient determinace r² ≥ 0.999 pro obě látky, což dokládá vynikající linearitu.
• Snímání na nejnižších úrovních bylo kvalitní (dobrý tvar píků v SIM i na nejnižších bodech kalibrace).

Spike recovery a opakovatelnost

• API vzorek: N‑nitrosoatenolol 1.5 ppm (vázáno na API) – recovery 106.6 %, RSD 3.0; 15 ppm – recovery 100.4 %, RSD 1.6. Atenolol impurity D při 15 ppm – recovery 96.3 %, RSD 3.3.
• Tablety (drug product): N‑nitrosoatenolol 1.5 ppm – recovery 106.4 %, RSD 1.8; 15 ppm – recovery 110.0 %, RSD 1.5. Atenolol impurity D při 15 ppm – recovery 103.0 %, RSD 1.9.
• Výsledky ukazují spolehlivou kvantifikaci NDSRI i mutagenní nečistoty při koncentracích odpovídajících jednomu desetinnému a plnému podílu AI limitu (pro atenolol AI limit 1 500 ng/day → 15 ppm rel. k API při dávce 100 mg/day).

Interference a řešení

• V analýze se objevil interferenční signál blízko retenční doby N‑nitrosoatenololu (R.T. ≈ 3.25 min) s m/z 295–296; tento signál je interpretován jako 13C izotop protonovaného N‑formylatenololu. Díky optimalizované separaci a vyhodnocení SIM signálů byl vliv interference minimalizován a kvantifikace považována za validní.

Přínosy a praktické využití metody

• Ukázaná kombinace LabSolutions MD + LCMS‑2050 poskytuje rychlý workflow pro vývoj metod vhodných pro screening a kvantifikaci NDSRI a mutagenních nečistot v produktu i v API, s minimální předúpravou vzorku (jednoduchá methanolická extrakce u tablet).
• Single‑kvadrupólová LC‑MS nabízí dostatečnou citlivost a přesnost pro rutinní kontrolu podle doporučených AI limitů, což umožňuje ekonomičtější a přístupnější alternativu k hmotnostním analizátorům vyšší třídy pro účely screeningových studií a QA/QC.
• Automatizovaná a AI‑podpořená optimalizace šetří čas při vývoji metod, zmenšuje počet experimentů a zvyšuje pravděpodobnost nalezení vhodných podmínek separace pro strukturově variabilní NDSRI.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření AI‑podpory pro predikci chromatografických podmínek a automatickou optimalizaci metod pro různé třídy NDSRI a široké spektrum API.
• Integrace workflows do standardních QA/QC procedur v průmyslových laboratořích pro kontinuální monitoring nitrosaminů v surovinách, meziproduktech a hotových formách.
• Další zlepšení selektivity např. pomocí selektivnějších ionizačních režimů, vyššího rozlišení MS nebo HRMS potvrzujících identitu podezřelých signálů (např. rozlišení izotopických interferencí jako N‑formylatenolol).
• Validace obdobných přístupů pro jiné API a rozšíření databází NDSRI s přiřazenými AI limity pro automatizované vyhodnocení rizika.

Závěr

Studie demonstruje, že systematický software‑podporovaný vývoj LC metod kombinovaný s citlivým single‑kvadrupólovým LC‑MS je plně použitelný pro screening a kvantifikaci NDSRI a mutagenních nečistot v léčivých přípravcích. Metoda poskytuje vynikající linearitu, vhodné limity kvantifikace pro regulatorní požadavky a dobré recovery a precisnost i při jednoduché přípravě vzorků. Přístup je praktický pro rutinní laboratorní nasazení a může ušetřit čas a náklady při zajištění souladu s regulačními požadavky.

Reference

1. US Food and Drug Administration. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry, Revision 2, September 2024.
2. US Food and Drug Administration. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance‑Related Impurities (NDSRIs) Guidance for Industry, August 2023.
3. US Food and Drug Administration. FDA Recommended AI Limits for Certain Hypothetical NDSRIs and Other Identified Nitrosamine Impurities, Updated March 19, 2026.
4. ICH M7(R2) Guideline. Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk. Adopted 24 May 2022.