Profiling Poloxamer Oxidation in Adeno-Associated Virus Formulations

Význam tématu

Poloxamery, zejména poloxamer 188, se prosazují jako alternativní neiontové surfaktanty v biofarmaceutických formulacích díky schopnosti stabilizovat proteiny a snižovat agregaci. I když nejsou náchylné k hydrolýze jako polysorbáty, představují oxidativní degradace vážné riziko ovlivňující bezpečnost a kvalitu léčivých produktů. Rychlé a citlivé monitorování integrity těchto polymerů je proto klíčové pro vývoj formulací, řízení rizik a sledování kritických kvalitativních atributů (CQA).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného application note bylo demonstrovat jednoduchý a robustní screeningový přístup ke sledování oxidace poloxameru 188 a vzniklých nečistot v neat vzorcích i v AAV formulacích. Autoři ukazují optimalizaci chromatografických a MS podmínek na sloupci Agilent AdvanceBio Surfactant Profiling spojeném se single quadrupole detektorem Agilent InfinityLab Pro iQ Plus a popisují, jak tyto podmínky umožňují rozpoznat chromatografické a hmotnostní změny spojené s degradací polymeru.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:
- Vzorky: neat poloxamer 188 a AAV8 formulace; oxidativní stres indukován Fentonovou reakcí (H2O2 + FeCl3) při 25 °C; odběr v čase T0, 1 den a 10 dní.
- Příprava: přímá injekce po umístění do HPLC vialů s glass inserty; žádná složitá extrakce či derivatizace.
- LC podmínky: mobilní fáze A = 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě; B = 0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu; sloupec AdvanceBio Surfactant Profiling 2.1 × 100 mm, 3.5 µm s guard; průtok 0,6 mL·min−1; teplota kolony 50 °C; gradient 5 → 95 % B za 4 min; needle wash methanol:voda 1:1.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity III LC (Bio High-Speed Pump G7132A, Bio Multisampler G7137A, Multicolumn Thermostat G7116B)
• Agilent AdvanceBio Surfactant Profiling HPLC column 2.1 × 100 mm, 3.5 µm (p/n 861775‑907) se strážným sloupcem (p/n 821126‑927)
• Agilent InfinityLab Pro iQ Plus single quadrupole mass detector (G6170A)
• Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detector (DAD, G7117B)
• Softwarové prostředí: Agilent OpenLab CDS verze 2.8 (použito i pro optimalizaci ESI parametrů)

MS parametry (vybrané):
- Ionizace ESI v pozitivním módu; m/z rozsah 100–2000; režim skenování; scan time ~1512 ms.
- Optimalizované zdrojové podmínky: teplota plynu 200 °C, nebulizér 30 psi, průtok plynu 12 L·min−1, kapilární napětí 3000 V, fragmentor 150 V. Tyto nastavení maximalizovaly TIC bez nadměrné in‑source fragmentace.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace LC a organického modifieru:
- Acetonitril jako organické fáze poskytl výrazně lepší signál a menší retenci než methanol, což umožnilo eluci hlavní poloxamerové populace uprostřed gradientu a větší analytické okno pro separaci degradačních produktů.

Optimalizace MS:
- Experimenty ukázaly, že fragmentor 150 V a kapilární napětí 3000 V poskytují optimální kompromis mezi intenzitou signálu a minimalizací in‑source štěpení, čímž se zlepšila detekce neiontového surfaktantu.

Degradace neat poloxameru pod Fentonovými podmínkami:
- Po 1 dni se objevil přední chromatografický „shoulder peak“ před hlavním pásmem poloxameru; po týdnu jeho intenzita vzrostla současně se snížením intenzity hlavního píku.
- Hmotnostní spektra ukázala posun k nižším m/z hodnotám u shoulder píku (např. z ~m/z 716 → ~m/z 643) a rozlišené iontové populace. Analyzované spektra vykazovala opakované ztráty 44 Da a 58 Da, interpretované jako ztráty jednotek PEO a PPO, což je konzistentní s řetězcovým štěpením polymeru.

Degradace v AAV formulaci:
- Degradace v přítomnosti AAV a histidinového pufru byla méně intenzivní než u neat vzorků, avšak zachovala se qualitativní signatura degradace: snížení hlavního píku a vznik předního shoulder píku.
- Reprodukovatelnost byla dobrá; CV procenta pro výšku degradation-associated shoulder píku byly kolem 3.5–4.1 % pro časové body T1 a T2.

Interpretace dat:
- Kombinace chromatografického posunu, snížení hlavního pásma a výskytu nižších m/z složek silně naznačuje oxidativní štěpení PPO/PEO bloků. Single quadrupole MS poskytuje sice omezené strukturní rozlišení, ale dostatečné pro rychlý screening trendů degradace a identifikaci charakteristických ztrát hmotností.

Přínosy a praktické využití metody

- Rychlý screening: krátký gradient (4 min) umožňuje vysokou propustnost vzorků a rychlou odezvu v rámci vývoje formulací a stability.
- Jednoduchost přípravy: přímá injekce bez složitých manipulací zkracuje čas analýzy a snižuje riziko artefaktů.
- Citlivost k oxidačním změnám: metoda detekuje chromatografické i hmotnostní známky degradace, včetně ztrát PEO/PPO jednotek.
- Kompatibilita s formulacemi: metoda funguje i v komplexních matricích, jako jsou AAV formulace, aniž by došlo k poškození kolony či přetížení MS při použitých podmínkách.
- Praktické využití: screening při vývoji formulací, stress‑testing, kontrola kvalitativních atributů surfaktantů během stability a podpůrné analýzy při root‑cause vyšetřování degradací.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření na kvantitativnější přístupy: kalibrace s oligomerními standardy nebo použití interních standardů pro kvantifikaci degradačních produktů.
- Vyšší hmotnostní rozlišení: zapojení HRMS (Orbitrap/TOF) nebo tandem MS pro přesnější určení struktury fragmentů a identifikaci oxidovaných koncových produktů (aldehydy, kyseliny).
- Automatizace a vysokopropustné skríningy v podnikovém prostředí pro rutinní monitoring CQA.
- Mechanistické studie: kombinace s izotopově značenými reaktanty nebo separačními technikami (SEC, LAC) pro studium konkrétních štěpných míst a kinetiky degradace.
- Aplikace na další excipienty: adaptace workflow pro polysorbáty a jiné surfaktanty, včetně porovnání odolnosti a produktů degradace.

Závěr

Studie ukazuje, že dobře optimalizovaná LC‑MS metoda se sloupcem AdvanceBio Surfactant Profiling a single quadrupole Pro iQ detektorem je efektivním nástrojem pro kvalitativní sledování oxidativní degradace poloxameru 188. Metoda umožňuje rychlé zachycení chromatografických a hmotnostních změn spojených s řetězcovým štěpením polymeru, funguje v neat i formulovaných matricích a je vhodná jako screeningový nástroj v rámci vývoje formulací, stability a řízení kvality.

Reference

1. Chen W.; Stolz S.; Wegbecher V.; Parakkattel D.; Haeuser C.; Oltra N. S.; Kishore R. S. K.; Bond S.; Bell C.; Kopf R. The Degradation of Poloxamer 188 in Buffered Formulation Conditions. AAPS Open 2022, 8, 5–19. DOI: 10.1186/s41120-022-00055-4.
2. Wang T.; Markham A.; Thomas S. J.; Wang N.; Huang L.; Clemens M.; Rajagopalan N. Solution Stability of Poloxamer 188 Under Stress Conditions. J. Pharm. Sci. 2019, 108, 1264–1271. DOI: 10.1016/j.xphs.2018.10.057.
3. Chen W.; Ross A.; Steinhuber B.; Hoffmann G.; Oltra N. S.; Kishore R. S. K.; Bond S.; Bell C.; Kopf R. The Development and Qualification of Liquid Adsorption Chromatography for Poloxamer 188 Characterization. J. Chromatogr. A. 2021, 1652, 462353–462362. DOI: 10.1016/j.chroma.2021.462353.
4. Bollenbach L.; Buske J.; Mäder K.; Garidel P. Poloxamer 188 as Surfactant in Biological Formulations—An Alternative for Polysorbate 20/80? Int. J. Pharm. 2022, 620, 121706–121726. DOI: 10.1016/j.ijpharm.2022.121706.
5. Hale W. A.; Koelmel J. P.; Godri Pollitt K. J. Reducing the Complexity of Polysorbate Oxidation By-Product Screening by LC/MS/MS. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8140EN, 2025.