Multipass Ion Mobility Separation of GLP-1 Receptor Agonist Impurities Using the SELECT SERIES™ Cyclic™ IMS

Význam tématu

Charakterizace a kvalitativní/kvantitativní určení stopových nečistot v biotechnologických léčivech, jako jsou agonisté receptoru GLP-1 (např. semaglutid), je klíčová pro bezpečnost pacientů i pro plnění regulatorních požadavků. Mnohé nečistoty jsou izomery vzniklé substitucí konfigurace aminokyselin (L→D) v dlouhých peptidových sekvencích; tyto izomery jsou často extrémně obtížně rozlišitelné pouze chromatografickými metodami. Proto je potřeba ortogonálních separačních technik, které umožní spolehlivou identifikaci a kvantifikaci takových nečistot v API i formulacích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat využití cyklické iontové mobility (Cyclic IMS) s možností více průchodů (multipass) a IMSn „slicing“ experimentech pro separaci, identifikaci a eventuální kvantifikaci tří D-aminokyselinových nečistot semaglutidu (D-Phe6, D-Ala19, D-Arg30), které se při standardní 60min UPLC metodě koelují a nejsou snadno rozlišitelné klasickým LC-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Postupy a přístrojové podmínky:

• Vzorky: syntetické standardy semaglutidu (veškeré L-aminokyseliny) a tři známé D-izomery (D-Phe6, D-Ala19, D-Arg30). Ředění pro přímé infuze na 1 µM ve vodě/acetonitril + 0,1 % kyseliny mravenčí; pro LC-MS na ~24,3 µM (1:10 ředění z 100 mM Tris HCl pH 7,5).
• LC: ACQUITY Premier UPLC se směšovačem QSM; ternární 60min gradient H2O/ACN/MetOH s 0,1 % TFA na ACQUITY Premier CSH C18 2.1×150 mm, 1.7 µm, 60 °C.
• MS/IMS: SELECT SERIES Cyclic IMS v režimu ESI+; akviziční rozsah m/z 50–2000; kapilární napětí 2.50 kV; cone voltage 40; standardní profily čtvercových filtrů uvedené v práci. Hlavní analyzované nabité stavy byly [M+3H]3+ (m/z ~1372) a [M+4H]4+ (m/z ~1029), přičemž lepší IMS separace byly dosaženy pro [M+4H]4+.
• Software a datová správa: MassLynx pro akvizici/řízení chromatografie, DriftScope pro vizualizaci a extrakci mobility dat; použití nástrojů jako pass calculator pro plánování multipass experimenů.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Při přímé infuzi byly všechny analyty pozorovány především jako třínásobně a čtyřnásobně protonované ionty; [M+4H]4+ poskytl výhodnější rozlišení v IMS dimenzi.
• Multipass IMS se sedmi průchody (7 pass) na směsi tří D-izomerů vygeneroval distribuci se dvěma blízkými (nevýrazně rozlišenými) vrcholy při driftových časech ~50.40 ms a ~51.42 ms a jedním téměř plně separovaným vrcholem při ~52.27 ms. Izolovaná analýza potvrdila přiřazení: D-Arg30 (~50.40 ms), D-Ala19 (~51.42 ms) a D-Phe6 (~52.27 ms).
• Navýšení počtu průchodů nad 7 samo o sobě nerozšířilo separation pro tyto dvě blízké izomery. Aplikací slicing IMSn (izolace mobility regionu s dvěma nevýraznými vrcholy do pre-array a následné znovuvstřikování s dalším počtem průchodů) bylo dosaženo baseline separace D-Arg30 a D-Ala19 po dalších 18 průchodech.
• Metodu bylo úspěšně přeneseno na LC-IM-MS: Během LC běhu byly v různých IMS kanálech současně akvírovány funkce (7 pass pro rozlišení D-Phe6 a slicing/18 pass pro rozlišení D-Arg30/D-Ala19). Extrakcí mobility chromatogramu pro jediný LC pík (koelující nečistoty kolem 42 min) se rekonstruovala stejná separace jako při přímé infuzi, což potvrzuje, že IMS workflow je kompatibilní s komplexními maticemi typickými pro formulace.

Interpretace: Kombinace multipass Cyclic IMS a cílených IMSn postupů poskytuje škálovatelnou separační sílu, která je ortogonální k LC. To umožňuje rozlišit strukturálně velmi podobné peptidové izomery bez nutnosti extrémně dlouhých nebo chemicky speciálních LC metod.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy uvedeného přístupu:

• Umožňuje spolehlivé rozlišení a identifikaci D-aminokyselinových izomerů v semaglutidu, které mohou uniknout běžné LC-MS analýze.
• Snižuje závislost na modifikaci LC gradientů nebo mobilních fází pro dosažení separace, což zjednodušuje metodologii a zkracuje vývoj metod pro QC.
• Poskytuje flexibilní nástroj pro analýzu komplexních formulací, kde dochází ke koeluci více nečistot.
• Podporuje kvantitativní analýzy prostřednictvím extrahovaných iontových chromatogramů (XIC) z jednotlivých IMS kanálů při simultánním provozu více IMS funkcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směřování a potenciální aplikace:

• Širší zavádění iontové mobility v QC laboratořích biofarmaceutik pro rutinní screening peptidových a proteinových impurit.
• Integrace CCS (collision cross section) knihoven pro rychlejší přiřazování izomerů a propojování s databázovými identifikacemi.
• Automatizace IMSn strategií a standardizované IMS workflow pro opakovatelné analýzy v regulovaných prostředích.
• Vývoj vyšší propustnosti návazných LC-IMS metod, včetně zkrácených LC metod, při zachování informační hodnoty díky IMS dimenzi.
• Možné využití kombinace s dalšími ortogonálními technikami (např. konformačně orientované MS/MS, derivatizace specifických pozic) pro hlubší charakterizaci izomerů.

Závěr

Studie ukazuje, že SELECT SERIES Cyclic IMS s multipass a slicing IMSn experimenty umožňuje dosáhnout baseline separace jednotlivých D-aminokyselinových izomerů semaglutidu, které jsou obtížně rozlišitelné pouze LC-MS. Metoda je flexibilní, přenositelná do LC-IM-MS pracovních postupů a nabízí spolehlivý přístup pro identifikaci a potenciální kvantifikaci kritických nečistot v API a formulacích, což má přímý přínos pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Fioramonte M., Gomes A. F., Kass I. J., Barros F., Biffi R., Oliveira I. M. Multipass Ion Mobility Separation of GLP-1 Receptor Agonist Impurities Using the SELECT SERIES Cyclic IMS. Application Note, Waters Corporation; Published August 03, 2026.