An Isocratic Separation of B Vitamins Using Waters XBridge Biphenyl RP Column with MaxPeak Premier Technology

Význam tématu

B vitaminy jsou klíčové, vodou rozpustné mikronutrienty, které se podílejí na metabolismu, energetickém metabolismu a nervové funkci. Jejich přesné a reprodukovatelné stanovení v potravinách, doplňcích stravy, farmaceutických a biologických matricích je zásadní pro zajištění kvality výrobků a pro výzkum výživy a kliniky. Analytická výzva spočívá v jejich polárním charakteru, nízkých koncentracích v matricích a citlivosti na prostředí, přičemž běžné C18 fáze mohou trpět pore dewetting při 100% vodném eluentu, což vede ke ztrátě retence a snížené reprodukovatelnosti. Současně mohou phosphorylované vitamery (např. pyridoxal 5'-fosfát) adhezovat na kovové povrchy, což degraduje tvar piku a citlivost.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit použitelnost sloupce Waters XBridge Biphenyl RP s technologií MaxPeak Premier pro izokratickou separaci vybraných B vitaminů s 100% vodným eluentem. Studie porovnala selektivitu a retenci biphenylové fáze s několika konkurenčními stacionárními fázemi, sledovala jev pore dewetting po zastavení průtoku a hodnotila vliv inertního povrchu MaxPeak Premier proti běžnému nerezovému hardware na odezvu phosphorylovaného vitamertu pyridoxal 5'-fosfátu (P5P).

Použitá metodika a instrumentace

Popis experimentu a přípravy:

• Složení testů: dvě směsi. První vzorek: uracil 10 µg/mL v 100 % acetonitrilu; druhý vzorek: uracil 10 µg/mL, nikotinová kyselina 32 µg/mL, nikotinamid 80 µg/mL, thiamin 50 µg/mL, pyridoxal 5'-fosfát 100 µg/mL v 10 mM amonném acetátu pH 4.6 (aq).
• Equilibrační postup: sloupec navlhčen 30 min 100 % acetonitrilem, injekce první směsi (3×), přechod 15 min v 50/50 ACN/water, následně 30 min 100 % vodného 10 mM amonného acetátu pH 4.6 a 3 počáteční injekce druhé směsi. Poté 10 min stop‑flow a po 1,2 min reekvilibraci další 3 injekce pro analýzu dewettingu.

Instrumentace a podmínky:

• LC systém: ACQUITY UPLC H‑Class (QSM, SM‑FTN, Column Manager, Aux CM) s ACQUITY UPLC PDA detektorem (500 nL flow cell).
• Řízení dat: Empower CDS.
• Sloupec: 2.1 × 50 mm (Waters XBridge Biphenyl) při 30 °C.
• Objem injekce: 1.0 µL; průtok: 0.2 mL/min; detekce UV při 250 nm.
• Mobilní fáze: A = 10 mM amonný acetát pH 4.6 (vodná), B = ACN, C = voda.
• Srovnávané fáze: ACQUITY Premier HSS T3, XBridge Premier BEH C18, XBridge Premier BEH Phenyl, XBridge Biphenyl (Waters) a biphenyl od Vendor R.
• Technologie MaxPeak Premier: povrchová úprava, která minimalizuje kontakt analyzátů s kovovým hardwarem a snižuje adsorpci phosphorylovaných sloučenin.

Hlavní výsledky a diskuse

• Selektivita a separace: Ze všech testovaných stacionárních fází dosáhly baseline separace všech čtyř vitaminů pouze biphenylové sloupce (Waters XBridge Biphenyl a biphenyl od Vendor R) při 100% vodném eluentu. Waters XBridge Biphenyl vykázal lepší tvar piku pro thiamin (USP tailing ≈1.67) než Vendor R (tailing ≈2.55).
• Příčiny rozdílů: lepší symetrie a nižší retence na sloupci Waters je přičítána nižší aktivitě zbytkových silanolů díky BEH částicím a proprietárnímu endcappingu, což snižuje iontové interakce s kationtovým thiaminem při pH 4.6.
• Pore dewetting: po 10min stop‑flow a následné reekvilibraci XBridge Biphenyl neprokázal známky pore dewettingu; pozorován byl jen mírný posun retence thiaminu.
• Vliv MaxPeak Premier na P5P: porovnání sloupce s nerezovým hardwarem a sloupce s MaxPeak Premier ukázalo ~36% vyšší maximální výšku piku a přibližně 15% vyšší plochu piku pro P5P u MaxPeak. U nerezového hardware se pozorovalo postupné kondicionování povrchu s nárůstem odpovědi přes šest injekcí a vyšší rozptyl výsledků.
• Důsledky: inertní povrch MaxPeak snižuje adsorpci phosphorylovaných vitamerních forem, zlepšuje citlivost, tvar píků a mezivzorkovou reprodukovatelnost, což je důležité pro kvantifikaci v doplňcích a komplexních matricích.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní izokratická metoda pro polární B vitaminy použitelná s 100% vodným eluentem bez rizika pore dewettingu na biphenylové BEH fázi.
• Lepší selektivita pro sloučeniny obsahující π‑elektrony (přínos biphenylové interakce) vedoucí k baseline separacím bez gradientu.
• Zvýšená citlivost a konzistence pro phosphorylované vitamery díky MaxPeak Premier, vhodné pro analýzy doplňků, potravin a farmaceutické kontroly jakosti.
• Jednodušší režim přípravy metody: méně komplikované přechody mobilních fází a kratší doba analýzy díky izokratickému režimu a krátkému sloupci 50 mm.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Adaptace metody do LC–MS/MS workflow pro zvýšení selektivity a nižších limitů detekce při zachování výhod biphenyl selektivity a inertního povrchu.
• Rozšíření na širší škálu vitamerních forem a souběžné stanovení dalších polárních mikronutrientů v komplexních matricích (biologické tekutiny, potravinové extrakty).
• Vývoj dalších inertních povrchů a modifikací hardware pro eliminaci interakcí s kovem u silně polárních nebo ionizovatelných sloučenin.
• Miniaturizace a zrychlení metodiky (UHPLC) pro vysokoprůtokové a vysokopropustné laboratoře QC.
• Standardizace postupů pro vývoj metod v souladu s regulačními požadavky na kvantifikaci vitamínů v potravinářství a farmacii.

Závěr

Waters XBridge Biphenyl RP Column ve spojení s MaxPeak Premier Technology představuje efektivní a robustní řešení pro izokratickou separaci B vitaminů v 100% vodných eluentech. Biphenylová selektivita umožnila baseline separaci vybraných vitamínů bez pore dewettingu a BEH/endcapping přispěly k lepšímu tvaru piku a nižší iontové interakci. Inertní povrch MaxPeak Premier významně zvýšil odezvu a reprodukovatelnost phosphorylovaného vitamerního piku P5P ve srovnání s nerezovým hardwarem, což zlepšuje citlivost a spolehlivost kvantifikace. Kombinace těchto vlastností je přínosná pro analytické laboratoře zabývající se potravinami, doplňky a farmacií.

Reference

1. Hanna M.; Jaqua E.; Nguyen V.; Clay J. B Vitamins: Functions and Uses in Medicine. Perm J. 2022;26(2):89-97.
2. Benvenuti M.; Shah D.; Burgess J.A. Selective Quantitative Determination of Water Soluble Vitamins in Various Food Matrices Using the ACQUITY UPLC H‑Class System and the ACQUITY QDa Detector. Waters Application Note. 2016.
3. Walter T.H.; Iraneta P.; Capparella M. Mechanism of retention loss when C8 and C18 HPLC columns are used with highly aqueous mobile phases. J Chromatogr A. 2005;1075:177-183.
4. Gritti F.; Walter T.H. Retention Loss of Reversed‑Phase Columns Using Highly Aqueous Mobile Phases: Fundamentals, Mechanism, and Practical Solutions. LCGC North America. 2021;39:33-40.
5. McDonald P.D.; et al. Topics in Liquid Chromatography Part 1. Designing a Reversed‑Phase Column for Polar Compound Retention. Waters White Paper. 2007.
6. Zabala G.; et al. A Highly Stable Biphenyl HPLC Stationary Phase Based on Ethylene‑Bridged Hybrid Particles. Waters Application Note. 2026.
7. Yang J.; Rainville P.D. Enhancing the LC–MS/MS Analysis of B Group Vitamins with MaxPeak High Performance Surfaces Technology. Waters Application Note. 2021.
8. National Institute of Health, Office of Dietary Supplements. Vitamin B6. Fact sheet for health professionals. 2026.
9. Lauber M.; et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces (HPS). Waters White Paper. 2021.