Confidence in Chromatography: Demonstrating Highly Reproducible HPLCCAD Performance with Waters Charged Aerosol Detectors

Význam tématu

Charged aerosol detection (CAD) v kombinaci s HPLC představuje citlivou a téměř univerzální detekční techniku pro nevolatilní a polovičně volatilní sloučeniny, které postrádají chromofor a jsou špatně detekovatelné běžným UV detekčním režimem. V praxi je HPLC-CAD široce využíváno při analýze excipientů, lipidů, surfaktantů, sacharidů, nečistot a degradačních produktů ve farmaceutickém a biofarmaceutickém výzkumu, vývoji i v kvalitativní a kvantitativní kontrole. Reprodukovatelnost signálu u CAD je kritická, protože závisí na procesu tvorby aerosolu; drobné rozdíly v nebulizaci, přívodu plynu, složení mobilní fáze nebo stavu nebulizéru mohou významně ovlivnit výsledky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikovaného dokumentu bylo prokázat vysokou míru opakovatelnosti kvantitativního výkonu mezi různými moduly Waters Charged Aerosol Detector (CAD) a rovněž dlouhodobou stabilitu signálu na jednom detektoru při praktických laboratorních podmínkách. Jako modelová metoda byla zvolena monografie USP pro deoxycholovou kyselinu (assay a organické nečistoty), což umožnilo posoudit splnění system suitability kritérií a porovnat výsledky napříč šesti CAD moduly a během více dní a přístrojů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vycházela z USP monografie pro deoxycholovou kyselinu. Vzorky a škály byly připraveny v 80:20 methanol:voda; standardy a vzorkové roztoky měly koncentrace 1 mg/mL (státy) a dále 0,010 mg/mL; citlivostní roztok byl 5 µg/mL.

Provozní podmínky (klíčové parametry):

• Kolona: XBridge BEH C18, 4.6 x 150 mm, 3.5 µm
• Teplota kolony: 30 °C (aktivní předehřev)
• Teplota evaporátoru CAD: 35 °C
• Teplota vzorku: 12 °C
• Objem injekce: 25 µL
• Průtok: 0.85 mL/min
• Mobilní fáze A: 0.1% kyselina mravenčí ve vodě; B: 0.1% kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Data rate CAD: 2 Hz

Analytické systémy a software:

• ACQUITY UPLC H-Class (QSM) s Waters CAD
• ACQUITY Arc System s Waters CAD
• Empower 3 (SR3 a 3.10) pro správu dat

Další poznámky k přípravě: použití LC/MS grade rozpouštědel a certifikovaných vialek; metoda převedena ze 3 µm na 3.5 µm kolonu pomocí kalkulačky sloupců.

Použitá instrumentace

Seznam přístrojů a klíčových komponent použitých v práci:

• Waters Charged Aerosol Detector (nová verze s optimalizovaným nebulizérem, každý nebulizér je individuálně kalibrován)
• ACQUITY UPLC H-Class Plus System
• ACQUITY Arc System
• XBridge BEH C18 4.6 x 150 mm, 3.5 µm
• Empower chromatografické softwarové prostředí

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní poznatky studie lze shrnout takto:

• Všechny šesti CAD moduly splnily požadavky system suitability pro assay i organické nečistoty metodiky USP pro deoxycholovou kyselinu.
• Chromatogramy napříč moduly byly prakticky identické co do retenčních časů i absolutního signálu, což dokládá nízkou mezimodulovou variabilitu při kontrolovaných podmínkách.
• Opakovatelnost signálu (intra-CAD RSD) se pohybovala v rozmezí přibližně 0.3–2.0% pro testované roztoky.
• Mezimodulová variabilita (inter-CAD RSD), zahrnující 18 nebo 36 injekcí napříč šesti detektory, byla v rozmezí 3.6–4.9% — hodnoty významně dobré pro nebulizační detektor pracující s nízkými signály (17–24 pA na rozsahu 0–500 pA).
• Dlouhodobá stabilita na jednom CAD: intra-day RSD 0.4–2.6%; inter-day RSD 3.2% při 42 injekcích během 17 dnů a napříč různými LC systémy a metodami.

Diskuse zdůrazňuje, že hlavní faktory ovlivňující CAD signál jsou kvalita nebulizace, čistota rozpouštědel a mobilních fází, stav nebulizéru a parametry přívodu plynu. Waters CAD minimalizuje variabilitu kombinací optimalizovaného nebulizéru a individuální kalibrace každého nebulizéru na cílový tlak, což přispívá k obdobné absolutní citlivosti modulu.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy potvrzené prací:

• Možnost spolehlivého přenosu HPLC-CAD metod mezi různými přístrojovými platformami bez nutnosti rozsáhlého přeoptimalizování.
• Vysoká opakovatelnost a nízká mezimodulová variabilita zkracují čas věnovaný odstraňování závad a opakovaným analýzám, což zvyšuje throughput laboratoří QA/QC.
• CAD tak poskytuje robustní alternativu nebo doplněk k UV detekci, zejména u látek bez výrazného chromoforu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Výsledky podporují následující budoucí směry:

• Širší nasazení CAD v rutinních QA/QC laboratořích pro analýzu excipientů, lipidů a nečistot, kde UV nedostačuje.
• Další vylepšení nebulizéru a automatizované řízení přívodu plynu by mohly dále snížit mezimodulovou variabilitu a zlepšit citlivost při nízkých koncentracích.
• Standardizace postupů přípravy mobilních fází a pravidelné kalibrace nebulizérů by se mohla stát součástí best practices pro laboratorní validaci HPLC-CAD metod při přenosu mezi lokalitami.
• Potenciální integrace s pokročilými datovými platformami pro sledování výkonu detektoru v čase a prediktivní údržbu.

Závěr

Studie ukazuje, že při dodržení doporučených postupů přípravy vzorků a mobilních fází, udržování čistoty systému a využití optimalizovaného a kalibrovaného nebulizéru lze dosáhnout vysoké reprodukovatelnosti HPLC-CAD metod jak napříč CAD moduly, tak v čase na jednom modulu. Naměřené intra-CAD RSD < 2% a inter-CAD RSD přibližně 3.6–4.9% potvrzují, že CAD poskytuje konzistentní kvantitativní výsledky i pro nízké koncentrace, čímž podporuje jeho použití v rutinních farmaceutických analýzách a při přenosu metod mezi přístroji.

Reference

1. Barnhart W. W., Farooq M. Q., Ahmad I. A. H. A. A Simplified Tutorial on Charge Aerosol Detection: Understanding the Basics, Optimization, and Troubleshooting. Journal of Chromatography Open, 2024, Article 100181.
2. Schilling K., Holzgrabe U. Recent applications of the Charged Aerosol Detector for liquid chromatography in drug quality control. Journal of Chromatography A, 2020, 1619:460911.
3. Vehovec T., Obreza A. Review of Operating Principle and Applications of Charged Aerosol Detector. Journal of Chromatography A, 2010, 1217:1549–1556.
4. United States Pharmacopeia. Deoxycholic acid. In USP–NF, 2020.