Comprehensive sequencing of cyclic peptides by top-down MS on a timsOmniplatform using next-generation fragmentation and OmniScapeprocessing

Komplexní sekvenování cyklických peptidů metodou top-down MS na platformě timsOmni s využitím pokročilého fragmentování a zpracování OmniScape

Význam tématu:
Cyklické peptidy představují významnou třídu bioaktivních molekul s širokým přesahem od farmacie po potravinářství. Díky vysoké specifitě vazby na antigeny, odolnosti vůči proteázám a příznivým membránovým vlastnostem jsou atraktivní pro vývoj léčiv. Strukturní modularita, přítomnost nekanonických AMK a makrocyklická konformace však komplikují jejich sekvenování běžnými proteolytickými a bottom-up přístupy. Robustní top-down workflow, které dokáže spolehlivě linearizovat a jednoznačně identifikovat primární linii cyklických peptidů, je proto pro výzkum i průmyslovou analytiku klíčové.
Účel studie a přehled:
Prezentovaný přístup spojuje iontovou mobilitu a high-end fragmentaci na platformě timsOmni s následným počítačovým zpracováním OmniScape (OSc). Cílem je systematicky generovat a vyhodnotit všechny možné „linearizované“ reprezentace cyklického peptidu včetně různých modifikací terminálních zbytků, přiřadit fragmenty (b/y, a/x, c/z a další) a určit nejpravděpodobnější primární sekvenci. Práce demonstruje metodu na příkladu cyklosporinu A a ukazuje přenositelnost na další deriváty.
Použitá metodika:
- Ionizace: kapalná ionizace (CaptiveSpray / Neos) v pozitivním i negativním režimu.
- Separace: iontová mobilita v tims kartridži pro oddělení konformací a filtraci podle CCS.
- Hmotnostní filtr: selekce prekurzorů před akumulací.
- Fragmentace: akumulace a řízené fragmentování v Omnitrap buňce s řadou režimů – kolizní techniky (CCID, RCID, xCID), rezonanční excitace a elektronově asistovaná fragmentace (trapped eXd / electron source).
- Detekce: ToF analýza fragmentů po kolekčním kondicionování v kolizní komoře (AIP).
- Zpracování: OmniScape softwarový workflow, který systematicky generuje všechny možní linearizace cyklického peptidu včetně kombinací terminálních modifikací, porovnává simulovaná fragmentace s experimentálními spektry a hodnotí shodu pomocí vícero scoring metrik.
Použitá instrumentace:

• Bruker timsOmni IMS Q-Omnitrap ToF (tims + Omnitrap + ToF detektor)
• Omnitrap cell s vestavěným electron source (trapped eXd)
• CaptiveSpray / Neos zdroje pro nano-/mikroionizaci
• Řízené akumulační segmenty Q2/Q5 s možností rezonantní excitace (RCID) a multi-step MSn
• OmniScape software pro exhaustivní linearizaci, PTM screening a anotaci fragmentů

Hlavní výsledky a diskuse:
- Systematické linearizování: pro 11-aminokyselinový cyklický peptid bylo vygenerováno více variant linearizace a pro každý lineární pořadí i různé kombinace terminálních modifikací. OmniScape prohledává tento prostor a hledá nejlepší vysvětlení experimentálních fragmentačních dat.
- Fragmentační režimy: kombinace CCID/RCID a elektronově asistované fragmentace efektivně generuje široké spektrum iontů (b/y, a/x, c/z), což zvyšuje pokrytí sekvence a pravděpodobnost jednoznačného určení lineární reprezentace.
- Příklad – cyklosporin A: nejlepší skórující linearizace (označená CSA6) dosáhla 100% pokrytí sekvence s jedinou chybějící y-štěpeninou; druhá a třetí nejlepší linearizace poskytly také vysoké pokrytí, ale s drobnými nedostatky v obsahu určitých typů fragmentů.
- Celkové vysvětlení spektra: OmniScape nejen identifikuje dominantní lineární sekvenci, ale odhaluje i nízko-abundantní fragmenty, které odpovídají alternativním linearizacím a umožňují kvantifikovat relativní příspěvky různých štěpných drah (branching ratios).
- Validace: přiřazení sekvencí podporují vícenásobné nezávislé scoring metriky a vysokokonfidenční anotace iontů, což zvyšuje důvěru v primární určení pořadí AMK.
Přínosy a praktické využití metody:

• Robustní top-down workflow vhodný pro struktury obsahující nekanonické AMK a makrocykly, kde tradiční enzymatické přístupy selhávají.
• Možnost komplexního PTM screeningu a testování různých terminálních modifikací bez nutnosti předchozí derivatizace.
• Vysoká přenositelnost – metoda byla úspěšně aplikována na více derivátů cyklických peptidů.
• Užitečné pro farmaceutický průmysl (identifikace kandidátů, QC), výzkumné laboratoře a screeningové programy s velkými knihovnami makrocyklických peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití:

1. Rozšíření automatizace: plná integrace workflow od datové akvizice po reporting s automatickým hodnocením více linearizací a PTM kombinací.
2. Quantifikace štěpných drah: kvantitativní odhad poměrů různých fragmentačních cest (branching ratios) pro hlubší mechanistické pochopení fragmentace cyklických peptidů.
3. Integrace s AI: využití strojového učení pro rychlejší priorizaci kandidátních linearizací a predikci fragmentačních vzorců pro nekanonické AMK.
4. Komplementární techniky: kombinace s lepší LC separací, vyšším rozlišením CCS nebo s pokročilými elektronovými metodami pro zvýšení citlivosti a selektivity.
5. Aplikace v regulované oblasti: validace workflow pro nasazení v QA/QC farmaceutických provozů, včetně standardizace scoring metrik a reportovacích kritérií.

Závěr:
Platforma timsOmni v kombinaci s OmniScape nabízí efektivní, výkonný a přenosný top-down přístup k sekvenování cyklických peptidů. Systematické generování všech možné linearizací a vyhodnocení pomocí bohatého spektra fragmentačních režimů umožňuje vysoké sekvenční krytí a spolehlivou identifikaci primární lineární reprezentace i u komplexních makrocyklických struktur. Metoda představuje praktický nástroj pro výzkum i průmyslové aplikace v oblasti objevování léčiv a analýzy makrocyklů.
Reference:

• Bartelmus C., Greisch J.-F., Smyrnakis A., Kosmopoulou M., Suckau D., Tremintin G., Papanastasiou D., Greig M. Comprehensive sequencing of cyclic peptides by top-down MS on a timsOmni platform using next-generation fragmentation and OmniScape processing. ASMS 2026 (prezentace, Bruker).