Top‐Down Mapping of Protein Modifications by Multimodal MSⁿ on the New timsOmni Platform

Význam tématu

Histony patří mezi klíčové proteiny regulující strukturu chromatinu a genovou expresi prostřednictvím rozmanitých posttranslačních modifikací. Detailní nativní mapování těchto modifikací na intactních proteinech pomáhá pochopit epigenetické mechanismy a jejich rolí v biologických procesech či onemocněních.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na aplikaci multimodálních MSn workflow (eXd MS2/MS3) na nové platformě timsOmni pro rychlou identifikaci proteoform a lokalizaci vícečetných acetylací na histonech H3 a H4. Cílem je dosáhnout vysokého pokrytí sekvence a přesného určení pozice koexistujících modifikací, včetně izomerů shodného m/z.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla využita platforma timsOmni, která kombinuje TIMS-Q-TOF s lineárním iontovým pastí Omnitrap. Fragmentační režimy zahrnovaly elektronovou disociaci (ECD), excitačně řízenou ECD (RCID) a ionizační disociaci (EID) v MS2 i MS3. Vzorky intactních histonů byly přímou infuzí pod ultrajemným podmínkami bez chromatografie.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí eXd workflow bylo dosaženo téměř 100% pokrytí aminokyselinové sekvence histonu H4 i H3. U histonu H4 bylo lokalizováno až sedm acetylací (K5, K8, K12, K16, K20, K31, K44) při náboji 13+. U nízkých acetylací (1–4 modifikace) dominovala acetylace N-konce (K5–K16). Pro histon H3.1 pak monoacetylace v poloze K14 jednoznačně potvrdily specifičnost enzymů GCN5 a PCAF.

Přínosy a praktické využití metody

• Intenzivní spektrální data z eXd MSn umožňují rozlišení izomerů a přesnou lokalizaci modifikací na intactních proteinech.
• Vysoké pokrytí sekvence zajišťuje spolehlivou identifikaci i komplexních proteoform.
• Metoda je využitelná v epigenetickém výzkumu, farmaceutickém vývoji a kvalitativní kontrole proteinových farmak.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj proti vysokopropustnému top-down proteomickému screeningu komplexních vzorků, integrace s bioinformatickými nástroji pro automa­tizovanou analýzu proteoform a rozšíření metodiky na další typy PTM (fosforylace, metylace) přinese další posun v epigenetice i klinické diagnostice.

Závěr

Multimodalní eXd MS2/MS3 na platformě timsOmni představuje výkonné řešení pro detailní top-down mapování koexistujících PTM na histonech. Metoda přináší téměř kompletní pokrytí sekvence a umožňuje přesnou lokalizaci vícečetných acetylací na intactních proteinech.

Reference

[1] Berthias F et al. Proteomics 2024, 24, e2200471
[2] Shliaha PV et al. Anal. Chem. 2018, 90(21), 12519-12526
[3] Papanastasiou D et al. JASMS 2022, 33(10), 1990-2007
[4] Henry RA et al. Biochemistry 2013, 52(34), 5746-5759