A User-Friendly, Regulatory-Compliant Multi-Attribute Method Workflow for Monitoring Critical Quality Attributes and Enabling Method Transfer

Význam tématu

Rychlý rozvoj bioterapeutik klade rostoucí nároky na systematické sledování kritických kvalitativních atributů (CQA) monoklonálních protilátek. Tradiční soubor ortogonálních metod je často časově i personálně náročný. Multi-attribute method (MAM) umožňuje konsolidovat lokalizovanou identifikaci modifikací a kvantifikaci vybraných CQA do jednoho LC-MS(-MS) workflow, což zrychluje rozhodování v rámci vývoje i kontroly jakosti (QC) a usnadňuje přenos metody mezi laboratorními prostředími při zachování regulační compliance.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem představeného posteru bylo demonstrovat uživatelsky přívětivý, regulačně kompatibilní workflow MAM pro komplexní identifikaci, verifikaci a rutinní monitoring CQA u trastuzumabu (Herceptin). Studie popisuje vývoj MAM na úrovni LC-MS/MS pro lokalizaci modifikací (fáze I) a následný převod validované metody do režimu MS-only pro QC sledování (fáze II). Důraz byl kladen na robustnost, přesnost kvantifikace a snadnost použití softwarových modulů pro analýzu a sledování trendů.

Použitá metodika

Vzorky: Herceptin byl stresován za kontrolovaných podmínek (5 mg/mL v 50 mM Tris-HCl pH 7.0) při 40 °C a 300 rpm s odběry v časech 0, 1, 4, 7, 14 a 28 dnů, aby se indukovaly modifikační změny relevantní pro CQA.

Preanalytika: Vzorky byly denaturovány (guanidin), redukovány (DTT) a alkylovány (iodoacetamid), následovala výměna pufru pomocí spin sloupců a trypsinová digestace; trávení bylo quenched kyselinou mravenčí. Podmínky přípravy byly optimalizovány tak, aby se minimalizovaly arteficiální modifikace.

Akvizice a analýza dat: Charakterizace proběhla na LC-MS/MS s Q-TOF (Agilent 6545XT) v Auto MS/MS režimu pro lokalizaci modifikací; pro rutinní monitoring byla použitá MS-only akvizice na Agilent 6230C TOF. K separaci sloužila reverse-phase peptide map kolona s průtokem ~0,25 mL/min a vyhřívaným sloupcem. Data byly shromažďována v OpenLab CDS a analyzována předvydaným softwarem Agilent BioConfirm a MAM Analysis Workflow 1.0 pro verifikaci a kvantifikaci CQA. Kvantifikace byla založena na EIC (extracted ion chromatogram) – procentuální zobrazení modifikace bylo spočítáno jako podíl plochy špičky modifikovaného peptidu ze součtu ploch modifikovaného a nemodifikovaného peptidu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III BioLC (peptidová mapovací kolona, reverzní fáze).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro LC-MS/MS (charakterizace, Auto MS/MS režim).
• Agilent 6230C LC/TOF pro LC-MS v MS-only režimu (QC monitoring po transferu).
• Softwarové nástroje: OpenLab CDS 3.0 (akvizice), Agilent BioConfirm 14.1 (verifikace peptidů), Agilent MAM Analysis Workflow 1.0 (monitoring a reporting).

Hlavní výsledky a diskuse

Identifikace a verifikace CQA: Metoda poskytla vysoké pokrytí sekvence (~89 % kombinovaného těžkého a lehkého řetězce) včetně kompletního pokrytí CDR oblastí. Auto MS/MS režim umožnil lokalizaci modifikací na úrovni fragmentačních iontů, např. lokalizovaná deamidace na konkrétním Asn v identifikovaném peptidu.

Definované a sledované CQA: Mezi sledované modifikace patřily deamidace, oxidace a isomerizace na konkrétních pozicích (příklady hotspotů: N55[HC], N84[HC], D102[HC], N30[LC], N289[HC] atd.). Tyto lokality byly validovány MS/MS daty jako relevantní pro QC.

Monitoring a trendy: Při stresování vzorků všechny sledované CQA vykazovaly nárůst v čase, přičemž některé pozice (např. N55[HC], D102[HC], N30[LC]) vykazovaly rychlejší nárůst než jiné, což indikuje vyšší reaktivitu/senzitivitu těchto míst. Kvantitativní výsledky byly reprodukovatelné napříč replikáty a umožnily jak individuální sledování hotspotů, tak agregovaný přehled (např. kumulativní deamidace).

Robustnost a transfer: Validovaný workflow prokazoval dostatečnou přesnost a opakovatelnost, což umožnilo přechod z MS/MS charakterizace na MS-only monitoring v QC bez ztráty schopnosti kvantifikace peptidových atributů.

Přínosy a praktické využití metody

• Konsolidace více analytických měření do jediného LC-MS(-MS) workflow s přímou lokalizací modifikací a kvantifikací, což šetří čas a zdroje v laboratořích vývoje i QC.
• Možnost fáze-děleného nasazení: podrobná charakterizace během vývoje (MS/MS) a rychlá rutinní kontrola v QC (MS-only) po ověření a přenosu.
• Uživatelsky přívětivé a regulačně kompatibilní softwarové rozhraní (MAM Analysis Workflow 1.0) zjednodušuje nastavení parametrů, sledování atributů a export výsledků pro trendovou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce MAM v prostředí QC vyžaduje další standardizaci, mezilaboratorní srovnání a harmonizaci validačních kritérií podle regulačních doporučení.
• Integrace lepších automatizačních nástrojů pro přípravu vzorků a kontroly kvality dat sníží variabilitu a zvýší propustnost workflow.
• Vývoj robustnějších algoritmů pro dekonvoluci a kvantifikaci EIC a lepší vizualizační nástroje podpoří rychlejší rozhodování při sledování trendů a investigacích odchylek.
• Potenciál pro rozšíření MAM na další třídy bioterapeutik (např. konjugované protilátky) a propojování s LIMS pro automatizované řízení kvality.

Závěr

Prezentovaný workflow ukazuje, že MAM postavený na Q-TOF LC-MS/MS pro charakterizaci a následném MS-only monitoringu poskytuje praktické, robustní a regulačně kompatibilní řešení pro sledování CQA u trastuzumabu. Kombinace cílené lokalizace modifikací, reprodukovatelné kvantifikace založené na EIC a uživatelsky přívětivého softwaru umožňuje efektivní přenos metody do QC prostředí a podporuje rutinní kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Xiu L., Knierman M., Miladi M., Sato S., Barkovich R., Horner-Buxton J. A User-Friendly, Regulatory-Compliant Multi-Attribute Method Workflow for Monitoring Critical Quality Attributes and Enabling Method Transfer. ASMS 2026 Poster MP 387; Agilent Technologies; 2026.
2. United States Pharmacopeial Convention. USP General Chapter <1060> Analytical Data—Interpretation and Treatment. Rockville, MD: USP; 2024.