Harmonizing Routine Oxylipin Profiling: A Multisite Evaluation of Inter-Laboratory Reproducibility

Harmonizace rutinního profilování oxylipinů – multisite hodnocení interlaboratorní reprodukovatelnosti

Význam tématu

Oxylipiny jsou biologicky aktivní lipidové mediátory vznikající oxidací polynenasycených mastných kyselin a hrají klíčovou roli v zánětlivých procesech, kardiovaskulárních onemocněních, neurodegeneraci a metabolických poruchách. Kvůli vysoké strukturální diverzitě izomerů a nízkým endogenním koncentracím je jejich analýza náročná a vyžaduje citlivé, selektivní a reprodukovatelné LC–MS/MS metody. Standardizace mezi laboratořemi je zásadní pro srovnatelnost dat v rozsáhlých klinických kohortách a pro meta-analýzy. Studie hodnotí, zda standardizovaná instrumentální konfigurace a protokol umožní robustní přenositelnost a nízkou technickou variabilitu mezi třemi nezávislými pracovišti.

Cíle a přehled studie / článku

Cíle studie byly následující:

• ověřit reprodukovatelnost retencí, ionizace a kvantitativní přesnost standardizované oxylipinové metody mezi třemi laboratořemi;
• posoudit, kolik z cílených 191 analytů lze spolehlivě detekovat a kvantifikovat napříč místy;
• identifikovat hlavní zdroje variability a potvrdit přenositelnost protokolu pro zavedení do rutinního provozu;

Zkoumání proběhlo na identických konfiguracích Agilent Infinity III Bio LC spojených s Agilent 6495D triple quadrupole (TQ) a zahrnovalo analýzu sdílených vzorků humánní plazmy po solid‑phase extrakci (SPE).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a příprava:

• Pooled plazma ředěná v ledové směsi 20:80 methanol:voda (v/v) se spikovanými těžce značenými interními standardy;
• obohacení oxylipinů pomocí C18 SPE kazet (Agilent Bond Elut);
• suché zbytky byly rekonstituovány v 50:50 methanol:voda (v/v) a distribuovány do tří pracovišť;

Chromatografie a MS (shrnutí parametrů):

• LC: Agilent 1290 Infinity III Bio LC; kolona Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 1.8 µm, 2.1×150 mm; teplota kolony 40 °C; autosampler 4 °C; injekce 10 µL;
• Mobilní fáze: A = voda + 0.1 % kyselina octová, B = 9/1 acetonitril/isopropanol; průtok 0.350 mL/min; gradientní program pokrývá 15–95 % B v průběhu metody tak, aby byl dosažen dobrý roz separation širokého rozmezí oxylipinů;
• MS: Agilent 6495D TQ v režimu dynamického MRM (dMRM) s minimální dobou dwell 10.1 ms; optimalizace zdroje s Cayman Chemical standardy a MassHunter Compound and Source Optimizer;
• Vybrané příkladné parametry zdroje: teplota pláště 290 °C, proud plynu 18 L/min, teplota obálky (sheath gas) 320 °C, proud 12 L/min, nebulizér 20 psi, kapilára −3000 V, nozzle −1600 V, iFunnel režim standard.

Poznámka k metodice: Přechody (transitions) byly zvoleny pro maximální izomerovou selektivitu; metoda cíleně pokrývá 191 analytů, z toho 17 těžce značených interních standardů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III Bio LC s konfigurací pro lipidové analýzy;
• Altura ZORBAX Eclipse Plus C18, 1.8 µm, 2.1×150 mm (katalogové číslo 204215‑308);
• Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS System s 4. generací dual‑stage iFunnel;
• Software: MassHunter 12.3 (Compound and Source Optimizer) pro optimalizaci a řízení dMRM;
• Referenční standardy: Cayman Chemical pro optimalizaci zdroje a ověření retencí a citlivosti.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekční pokrytí: Ze 191 cílových analyzovaných sloučenin bylo v daném pooled plazmovém extraktu zaznamenáno celkem 100 analytů na alespoň jednom systému a 80 analytů bylo konzistentně detekováno ve všech třech laboratořích. Nižší počet napříč všemi místy byl přisouzen stabilitě vzorků při transportu a drobným rozdílům v LC/MS výkonu pro nízko odpovídající analyty.
• Stabilita retencí: Pro 19 reprezentativních endogenních oxylipinů rozprostřených napříč chromatogramem byla prokázána vysoká přesnost retencí mezi třemi pracovišti; uvedený údaj uvádí RT variabilitu <0.1 % RSD pro 80 analytů detekovaných na všech místech.
• Kvantitativní přesnost a opakovatelnost: Overlay chromatogramů (n=20 injekcí) pro 12,13‑DiHOME ukázal velmi stabilní RT a tvar píku, což potvrzuje konzistentní výkon metody při sekvenční analýze.
• Izomerová separace: Altura ZORBAX kolona s Ultra Inert povrchem výrazně zlepšila tvar píků u kovově citlivých funkčních skupin a umožnila rozlišení regioizomerů epoxidů a dihydroxy kyselin získaných z EPA, AA, LA a DHA.
• Hlavní zdroje variability: logistika vzorků (transport, skladování), nízká hladina některých analyzovaných sloučenin, a drobné rozdíly v optimalizaci zdroje nebo stavu MS systému.

Přínosy a praktické využití metody

• Přenositelnost: Standardizovaná instrumentální konfigurace a protokol umožňují snadnou adopci v nových laboratořích; kompatibilita se standardními SPE protokoly zjednodušuje zavedení metody do rutinního provozu;
• Široké pokrytí: Metoda poskytuje cílené pokrytí významných biosyntetických cest oxylipinů (CYP, LOX) a detekci rezolvinů, epoxidů, dihydroxylovaných derivátů apod.;
• Vysoká opakovatelnost: Nízká variabilita retencí a stabilní chromatogramy podporují vysokou propustnost a spolehlivost při sledování biomarkerů v klinických studiích;
• Využití v výzkumu i QA/QC: Metoda je vhodná pro rutinní profilování v translational výzkumu, farmacometabolomice a monitoringu zánětlivých markerů v klinických koherentních studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší pokrytí interními standardy: Rozšíření sady těžce značených standardů může zlepšit kvantifikaci izomerů a snížit variabilitu pro nízko hladinové analyty;
• Standardizační programy a proficiency testing: Organizované mezi‑laboratorní studie a referenční materiály pro oxylipiny posílí srovnatelnost dat napříč institucemi;
• Integrace s jinými omics platformami: Kombinace oxylipinomiky s lipidomikou a metabolomikou pro komplexnější biologické interpretace;
• Automatizace a vysoká propustnost: Další zefektivnění přípravy vzorků a datových toků pro velké kohorty;
• Pokrok v instrumentaci a softwaru: Vyšší citlivost, lepší iFunnel designy a pokročilé algoritmy pro zpracování dMRM dat zlepší detekci nízko abundentních izomerů.

Závěr

Standardizovaný LC–MS/MS protokol založený na Agilent Infinity III Bio LC a 6495D TQ prokázal vysokou reprodukovatelnost retencí a konzistentní výkon napříč třemi laboratořemi. Metoda je široce přenosná, kompatibilní se standardními SPE postupy a poskytuje robustní rámec pro rutinní vysokopropustné profilování oxylipinů v klinickém a výzkumném prostředí. Hlavní omezení spočívají v logistice vzorků a potřebě doplnit krytí těžce značenými standardy pro lepší kvantifikaci nízko odpovídajících analytů. Studie ukazuje, že harmonizovaná instrumentální konfigurace může významně snížit technický šum a podpořit širší adopci oxylipinových analýz.

Reference

1. Strassburg J, et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012.
2. Rashan AM, et al. Nature Structural & Molecular Biology, 2025.
3. Yannell KE, et al. An End‑to‑End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Application Note 5994‑5628EN, 2023.
4. Huynh K, et al. A Comprehensive, Curated, High‑Throughput LC/MS/MS Analysis of Bile Acids in Biological Samples. Agilent Application Note 5994‑86263EN, 2025.
5. Morlacchi P, et al. Deciphering the Microbiome: Targeted Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Application Note 5994‑3447EN, 2021.
6. Silva B, et al. Quantification of Underivatized Acylcarnitines and Carnitine Intermediates using RP Chromatography and Ion Funnel Triple Quadrupole in Fecal Samples. ASMS Poster, 2025.