Eliminate Metal Ions from Your Oligonucleotide LC/MS Analysis

Význam tématu

Analýza oligonukleotidů pomocí LC/MS je klíčová v biotechnologiích a farmaceutickém výzkumu pro charakterizaci sekvencí, kontrolu kvality a detekci nečistot. Metalické ionty přítomné v běžných nerezových průtokech HPLC systémů (zejména Fe2+/Fe3+) a alkalické kovy (Na+, K+) mohou ovlivnit retenci, snížit obnovu analytů, způsobit špičkování či tvorbu aduktů v mass spektrech. Eliminace těchto nežádoucích interakcí zvyšuje citlivost, přesnost měření a produktivitu laboratorních metod, zejména při detekci minoritních komponent a při práci s citlivými nebo modifikovanými oligonukleotidy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikovaného note bylo demonstrovat, jak snížit dopad kovových interakcí při LC/MS analýze oligonukleotidů. Autoři porovnali tradiční ion-pair reverzní fázi (s hexylaminem + HFIP) a ion-pair–free reverzní fázi (amoniakální hydrogenuhličitan + methanol) na jednom typu sorbentu (Agilent AdvanceBio Oligonucleotide), přičemž testovali vliv ultra-inertního povlaku kolony Altura Oligo HPH‑C18 versus standardní nerezové (stainless steel, SS) provedení. Studie dále sledovala vliv průtokové rychlosti, materiálu lahví na rozpouštědla a přípravy vzorku na úroveň aduktů a kvalitu spektrálních výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Porovnání ion-pair RP (10 mM hexylamin + 50 mM HFIP v methanol/vodě) versus ion-pair–free RP (20 mM amonný hydrogenuhličitan / methanol).
• Testované kolony: Agilent AdvanceBio Oligonucleotide (SS) a Agilent Altura Ultra Inert Oligo HPH‑C18 (povlak).
• Různé průtokové rychlosti a gradienty; optimalizace nižším průtokem ke zlepšení tvaru píku a rozlišení nečistot.
• Opatření ke snížení alkalických aduktů: použití polypropylénových lahví, čerstvá ultrapure voda, minimalizace expozice sklu a iontových kontaminantů.

Instrumentace (použité přístroje a SW):

• Agilent 1290 Infinity II pumpa, multisampler, multikolonový termostat, diode array detektor (DAD)
• Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF LC/MS
• Agilent MassHunter Acquisition a MassHunter Qualitative Analysis

Další experimentální poznámky:

• Vzorky: syntetické oligonukleotidy – 25 mer DNA, 50 mer DNA a plně thiolovaný DNA/RNA hybrid; koncentrace 1 mg/mL v ultrapure vodě.
• Pro snížení kontaminantů byly použity MS-grade rozpouštědla a polypropylénové lahve na rozpouštědla.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolony s ultra-inertním povlakem (Altura Oligo HPH‑C18) vykazovaly výrazně vyšší obnovu a větší UV/MS peak area při opakovaných injekcích než nerezové (SS) kolony. Inicialní adsorpce oligonukleotidů na exponovaných kovových místech u SS kolony vedla k nižšímu signálu při prvních injekcích.
• Snížení průtoku vedlo k lepšímu tvaru píku a lepšímu rozlišení nečistot; zároveň se změnila distribuce nabití (charge state distribution) a došlo k redukci aduktů u některých nabitých stavů.
• Alkaliční addukty (Na+, K+) byly pozorovány u obou typů kolon a projevovaly se jako posuny m/z o +22, +38 a jejich kombinace. Tyto addukty značně komplikují interpretaci spekter a dekonvoluci masy.
• Přechod na ion-pair–free metodu (amonný hydrogenuhličitan) a použití pozitivního ionizačního režimu MS vedly ke snížení úrovně aduktů a ke zmírnění některých negativních efektů HFIP (PFAS obavy). Ion-pair–free metoda také posunula optimální nabíjecí rozložení směrem k vyšším kladným nabitým stavům, což zlepšilo citlivost v pozitivním módu.
• U plně thiolovaného oligonukleotidu byla chromatografická šíře píku větší kvůli přítomnosti diastereomerů, avšak dekonvoluovaná (průměrná/monoisotopická) hmotnost zůstala jednoznačná.
• Tabulka porovnání (synthéza výsledků) ukázala, že Altura UI kolona poskytuje lepší přesnost naměřené monoisotopické hmotnosti (menší ppm chyby) než SS kolona, zejména u modifikovaných oligonukleotidů. Nižší průtok také zlepšil přesnost (snížení ppm chyby u plně thiolovaného ON z extrémních hodnot u SS).

Přínosy a praktické využití metody

• Použití ultra-inertního povrchu kolony výrazně zvyšuje obnovu, citlivost a reprodukovatelnost LC/MS analýz oligonukleotidů – klíčové při detekci stopových nečistot a při validaci výrobních postupů.
• Ion-pair–free metody s amonným hydrogenuhličitanem nabízejí životaschopnou alternativu k HFIP, s nižší environmentální zátěží (PFAS) a s menší pravděpodobností silné ion-suprese v MS.
• Praktická doporučení: použití polypropylénových lahví, MS-grade reagentů, pečlivá příprava vzorků a snížení průtoku pro lepší chromatografii a nižší addukční rušení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj stacionárních fází s ještě nižší interakcí s kovovými ionty a nové povlakovací technologie pro HPLC komponenty; širší adopce materiálů s nízkým obsahem železa (např. MP35N) pro konstrukci průtokových cest.
• Zvyšující se preference ion-pair–free metod z důvodu regulací a hledání náhrad PFAS sloučenin; souběžné optimalizace mobilních fází a MS podmínek pro pozitivní ionizační režim.
• Integrace postupů pro aktivní odsolování a de-addukci při přípravě vzorků (např. použití vhodných desaltingových kroků nebo spotřebního materiálu bez alkalických kontaminantů) a automatizace těchto kroků v centrálních laboratořích.
• Využití pokročilých algoritmů dekonvoluce a softwarových nástrojů pro lepší identifikaci aduktů a přesnější určování monoisotopických hmotností u velkých oligonukleotidů.

Závěr

Přechod na ultra-inertní HPLC hardware (Altura Oligo HPH‑C18) a implementace pečlivých laboratorních postupů (minimalizace alkalických iontů, použití polypropylénových lahví, optimalizace průtoku) výrazně snižuje negativní dopady kovových interakcí při LC/MS analýze oligonukleotidů. Ion-pair–free metody s amonným hydrogenuhličitanem poskytují dobrou alternativu k HFIP obsahujícím postupům, zlepšují MS výstupy a omezují environmentální rizika spojená s PFAS. Výsledkem je lepší citlivost, přesnost hmotnostní analýzy a robustnější workflow pro farmaceutické a biofarmaceutické aplikace.

Reference

1. Vanhoenacker G.; et al. Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides. Agilent Technologies application note, publication number 5994-2957EN, 2024.
2. Bertram L.; Hsiao J. Analysis of Oligonucleotides Using an Ion‑Pairing‑Free Reversed‑Phase Method with TOF LC/MS. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8013EN, 2024.
3. Hsiao J.; Bertram L.; et al. Evaluating HILIC Stationary Phases for Oligonucleotide Separation by LC/MS. Agilent Technologies application note, publication number 5994-8180EN, 2025.