Trace Level estimation of Glyphosate and Glufosinatein Red Chilli Pepper using FMOC-derivatization

Význam tématu

Glyphosate a glufosinate patří mezi široce používaná herbicida, jejichž přítomnost v potravinách má přímý dopad na bezpečnost potravin a regulaci obchodovaných komodit. Analýza těchto vysoce polárních sloučenin v náročných rostlinných matricích, jako je červené chilli, je analyticky náročná kvůli špatné chromatografii, nízké ionizovatelnosti a silnému matričnímu efektu. Derivatisation pomocí FMOC-Cl zlepšuje chromatografické chování i detekční citlivost a umožňuje dosáhnout požadovaných limitů stanovení podle mezinárodních norem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit metodiku pro stanovení stopových koncentrací glyphosatu a glufosinátu v prášku z červeného chilli pomocí FMOC-derivatisace a LC/TQ (triple quadrupole) detekce. Metoda měla dosáhnout LOQ 0,001 mg/kg (1 µg/kg), splňovat požadavky SANTE a být použitelná jak v ESI negativním, tak pozitivním režimu.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku:

• Odběr: 2,5 g vzorku červeného chilli (prášek).
• Extrakce: 10 mL 1 % kyseliny mravenčí + extrakce 10 mL dichlormethanu, centrifugace.
• Derivatisace: do 1 mL supernatantu přidáno 0,7 mL 5 % borátového pufru a 0,3 mL FMOC-Cl (40 mM); reakce při 40 °C po dobu 45 min ve tmě za kmitání.
• Ukončení: přidání 0,05 mL kyseliny mravenčí, ochlazení a centrifugace 5000 rpm po 5 min.

Chromatografie a MS parametry (shrnutí):

• Analytická kolona: Agilent P/N 693975-302, tepelná úprava 40 °C.
• Mobilní fáze: A = 5 mM amonný acetát; B = methanol. Gradient: start 99 % A/1 % B, přechod na 1 % A/99 % B do 7 min, návrat a re-equilibrace do 13 min; průtok 0,4 mL/min; injekce 20 µL.
• Autosampler: 5 °C; injekční objem 20 µL.
• Ionizace: ESI-AJS v pozitivním i negativním režimu; capilární napětí +2700 V (pozitivní), -3500 V (negativní); nozzle ±500 V.
• Parametry plynu: drying gas 9 L/min při 300 °C, sheath gas 10 L/min při 300 °C, nebulizer 35 psi.
• Platforma: Agilent 1290 UHPLC spojený s Agilent 6475 LC/TQ.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II UHPLC.
• Agilent 6475 Triple Quadrupole LC/MS.
• Kolona Agilent P/N 693975-302.
• Standardní laboratorní vybavení: centrifuga, vodní lázeň s kmitáním, chladicí autosampler.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost a linearitu v rozsahu 0,001–0,1 mg/kg (1–100 ppb). V ESI negativním režimu byly dosaženy hodnoty r2 > 0,9996 (glufosinate) a > 0,9997 (glyphosate) s kvalitními, dobře rozlišenými píky a lepším poměrem signál/šum než v pozitivním režimu. Negativní režim měl rovněž čistší základní čáru a menší matriční interferenci. V ESI pozitivním režimu byly zjištěny o něco vyšší rušivé vlivy matice a mírně horší S/N, avšak linearita s r2 > 0,995 ukázala, že i tento režim je pro metodu použitelný.

Matrix blank vykazoval signály výrazně pod cílovou LOQ 0,001 mg/kg, což potvrzuje vhodnost přípravy vzorku a dostatečnou selectivitu po FMOC-derivatisaci. Metoda rovněž splnila kritéria iontových poměrů vyžadovaná SANTE/2026, což zvyšuje spolehlivost identifikace v rutinním provozu.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje spolehlivé stanovení glyphosatu a glufosinate v náročném rostlinném matrixu (červené chilli) při LOQ 0,001 mg/kg, což překračuje požadavky některých regulačních limitů.
• Derivatisace FMOC-Cl zlepšuje chromatografii a ionizovatelnost polárních kyselých pesticidů, čímž redukuje falešné negativní výsledky.
• Metoda je flexibilní — použitelná v negativním i pozitivním ESI režimu — což usnadňuje její implementaci v komerčních a státních laboratořích s různou instrumentací.
• Pre-spike příprava a validace ukázaly dobré recoveries, což podporuje aplikovatelnost pro rutinní kontrolu jakosti potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace stabilně značených vnitřních standardů (izotopových) pro další zlepšení přesnosti a korekce matričních efektů.
• Rozšíření metodiky na více reziduí současně (multi-residue panels) a optimalizace pro vysokorychlostní screening.
• Využití vysokého rozlišení (HRMS) pro potvrzovací analýzy a zpřesnění identifikace neznámých interferentů.
• Automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro zvýšení průchodnosti laboratoří a snížení spotřeby organických rozpouštědel v souladu s principy green chemistry.

Závěr

FMOC-derivatisace v kombinaci s LC/TQ nabízí robustní a citlivou metodiku pro stanovení glyphosatu a glufosinate v náročném matrixu červeného chilli. Metoda dosahuje LOQ 0,001 mg/kg, splňuje požadavky SANTE a regulací (FDA, EU, FSSAI) a je vhodná pro rutinní použití v komerčních laboratořích díky své flexibilitě v použití ESI režimů a dobrým validačním parametrům.

Reference

1. Code of Federal Regulations, Title 40, Part 180, Subpart C — tolerances and exemptions for pesticide chemical residues (USA regulatory framework).
2. European Commission, EU Pesticides Database — Maximum Residue Limits (MRLs) for glyphosate and glufosinate.
3. FSSAI Compendium of Contaminants and Residues Regulations, 2026 (Food Safety and Standards Authority of India).