Význam tématu
Kontaminant N‑nitrosodimethylamin (NDMA) vyvolal rozsáhlé stažení lékových forem metforminu a dalších léčiv. Přesné a spolehlivé kvantifikování stopových hladin NDMA v tabletách je proto kritické pro bezpečnost pacientů, farmaceutickou kontrolu kvality a regulatorní shodu. Zejména v kombinovaných prodlouženě uvolňovaných (ER) formulacích s empagliflozinem je nutné zabránit falešně pozitivním výsledkům způsobeným rušením z přítomného N,N‑dimethylformamidu (DMF).
Cíle a přehled studie
Cílem posterové studie bylo vyvinout vysoce citlivou a reprodukovatelnou LC/TQ metodu pro ultra‑stopovou kvantifikaci NDMA v ER tabletách obsahujících empagliflozin a metformin, která současně efektivně oddělí potenciálně rušící DMF. Metoda má mít dostatečnou citlivost k detekci v řádu desetin ppm a robustní opakovatelnost vhodnou pro rutinní kontrolu kvality.
Použitá metodika
Vzorky: ER tablety s empagliflozinem (varianty 5, 10, 12.5 a 25 mg empagliflozinu s 1 g metforminu) byly rozpouštěny ve vodě a před finálním naředěním byl přidán methanol, čímž se zabránilo vzniku gelu typického pro metforminové formulace a umožnilo se spolehlivé připravení vzorku pro chromatografii.
Chromatografie a akvizice: Byla použita reverzní UHPLC separace s gradientem z vodné fáze (0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě) do organické fáze (0,1 % kyseliny mravenčí v methanolu). Detekce probíhala dvojím kanálem: UV monitorování API (cca 220–225 nm) a selektivní měření pomocí tandemového hmotnostního spektrometru v dynamickém MRM režimu.
Klíčové prvky přípravy vzorku: přidání methanolu před konečným naředěním zabránilo gelování a zlepšilo extrakci. Použití interního standardu je doporučeno pro korekci zotavení u fáze‑změna založených postupů pro metforminové ER formulace.
Použitá instrumentace
- UHPLC: Agilent 1290 Infinity III.
- Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6495D Triple Quadrupole (LC/TQ) s APCI ionizací v pozitivním režimu.
- Kolona: PFP (perfluorfenyl), 3 mm × 150 mm, 2.7 µm, teplota 40 °C.
- Autosampler nastaven na 10 °C, injekční objem 5 µL.
- MS podmínky: zdroj APCI +, dynamické MRM, odklon UV toku do MS v časovém okně 3,5–21 min.
- Mobilní fáze: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě (A) a v methanolu (B) s programovaným gradientem vracejícím se do výchozí složení po 13,1 min.
Hlavní výsledky a diskuse
Oddělení NDMA a DMF: MRM signály NDMA a DMF byly dobře rozděleny—NDMA elučně kolem 5.7 min a DMF kolem 6.0 min—což minimalizovalo chybné kvantifikace NDMA způsobené souběžným elucí DMF. API (empagliflozin a metformin) elutovaly výrazně dříve (~3.1 min) a nezasahovaly do MRMs pro NDMA/DMF při použitých podmínkách.
Citlivost a linearita: Kalibrace byla provedena v rozsahu 0.024–0.250 ppm pro NDMA a vykázala výbornou linearitu s koeficientem determinace r2 = 0.9998. Metoda dosáhla citlivosti až 0.024 ppm (hranice kvantifikace v této práci).
Opakovatelnost a recovery: Při spikování NDMA na úrovni 0.048 ppm v odpovídajících množstvích matice (10 mg metforminu) byla zjištěna průměrná zotavení v rozmezí 99–105 % u testovaných formulací (S31–S34). Relativní směrodatná odchylka pro opakované injekce NDMA na úrovni 0.048 ppm byla <5 % (konkrétně 4.67 %), což potvrzuje reprodukovatelnost metody.
Matice a LOQ: Nespikované vzorky většinou vykazovaly signály pod LOQ pro NDMA, což ukazuje, že metoda je vhodná pro screening nízkých hladin a pro potvrzování přítomnosti NDMA nad stanovenou hranicí.
Přínosy a praktické využití metody
- Metoda umožňuje spolehlivou detekci a kvantifikaci NDMA v přítomnosti DMF, čímž snižuje riziko falešně pozitivních výsledků, které mohou vést k neopodstatněným stažením produktů.
- Vysoká linearita a nízké RSD zajišťují vhodnost pro rutinní QC laboratoře a regulatorní testování v rámci bezpečnostních programů léčiv.
- Přidání methanolu do přípravy vzorku je jednoduchý krok, který výrazně zlepšuje manipulaci s metforminovou matricí a konzistentnost výsledků.
Budoucí trendy a možnosti využití
- Dále lze zlepšit robustnost metodou s izotopově značeným interním standardem (isotope‑dilution) pro korekci matrixových efektů.
- Implementace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro potvrzování struktur a snížení rizika interferencí při komplexních matricích.
- Automatizace přípravy vzorků a validace metody pro širší spektrum tabletových formulací a dalších N‑nitrosaminů souvisejících s farmaceutickými produkty.
- Harmonizace metodik napříč laboratořemi a regulatorními orgány tak, aby byly limity a postupy konzistentní při mezinárodních šetřeních kontaminantů v léčivech.
Závěr
Prezentovaná LC/TQ metoda na platformě Agilent 1290 Infinity III / 6495D dosahuje vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti pro kvantifikaci NDMA v empagliflozin‑metformin ER tabletách a současně efektivně rozlišuje NDMA od DMF. Lineární rozsah a nízké RSD spolu s vysokými recoveries činí metodu vhodnou pro rutinní kontrolu kvality a podporu regulatorních požadavků týkajících se N‑nitrosaminů.
Reference
- U.S. Food and Drug Administration. Product label (2016) – informace o přípravku uvedeném v registrační dokumentaci (label) FDA, 2016.
- Publikace dostupná v PubMed, PMID: 32613429; DOI: 10.1208/s12248-020-00473-w (studie zabývající se interferencemi a analýzou NDMA a DMF).
- Publikace v ACS (operational research/product development), DOI: 10.1021/acs.oprd.5c00308 (metody přípravy vzorků a využití interních standardů pro metforminové formulace).
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
