Comparison of biocompatible and inert UHPLC systems for LC-UV quantitation of large RNA

Porovnání biokompatibilních a inertních UHPLC systémů pro kvantifikaci velkých RNA pomocí LC-UV

Význam tématu

Analýza velkých RNA a oligonukleotidových terapeutik vyžaduje vysoce inertní chromatografické průtokové cesty. Negativně nabitý fosfodiesterový řetězec RNA může interagovat s kovovými povrchy v systému, což vede ke ztrátě analytu, roztažení píků a snížené citlivosti, obzvláště při nízkých koncentracích. Optimalizace průtokových cest a použití inertních materiálů je tedy klíčové pro spolehlivé kvantitativní analýzy v oblasti QC a vývoje RNA léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo porovnat výkon nového inertního UHPLC systému Vanquish Amplify (s inertním povlakem průtokových komponent) s konvenční biokompatibilní konfigurací využívající MP35N slitinové kapiláry a s komerčně dostupným inertním systémem (Acquity Premier / MaxPeak HPS). Testovacími analyty byly: (i) adenosin 5′-(α,β-methylen) difosfát (AMPcP) jako sondní, metal-senzitivní látka, (ii) adenosin jako nereagující referenční sloučenina a (iii) směs velkých RNA fragmentů o délce 500 a 5000 nukleotidů separovaná ion-párovou reverzní fází (IP-RPLC).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• IP-RPLC separace velkých RNA s použitím TEAA jako ion-párujícího pufru.
• Test AMPcP/adenosin: mobilní fáze 10 mM amonium-acetát s pH upraveným na 5.2, 6.7 a 8.7 pro sledování vlivu pH na sekundární interakce s kovovými povrchy.
• Mobilní fáze pro velkou RNA: Eluent A = 100 mM triethylammonium acetát (TEAA); Eluent B = 100 mM TEAA/ACN (75/25, v/v).
• Pokusy zahrnovaly cykly po pěti injekcích v průběhu tří dnů, až ~50 injekcí na systém pro posouzení reprodukovatelnosti a kondičních efektů.

Instrumentace:

• Vanquish Amplify UHPLC system (inertní povrchy průtokové cesty s povlakem).
• Vanquish se standardními MP35N kapilárami (biokompatibilní konfigurace).
• Waters Acquity Premier UPLC systém s MaxPeak HPS jako srovnávací inertní platforma.
• Kolona: Thermo Scientific SurePac Oligo RP MDi, 2.5 µm, 2.1 × 50 mm (P/N: 43712-052132).
• Detekce: Diodový array detektor (DAD) umístěný downstream na obou srovnávaných systémech pro konzistentní podmínky detekce.
• Software pro akvizici a analýzu dat: Thermo Scientific Chromeleon 7.3.2 CDS.

Vzorky a příprava:

• AMPcP a adenosin smíšeny v ekvimolárním roztoku o koncentraci 11.7 µM.
• RNA: směs 500 nt a 5000 nt fragmentů (Invitrogen), naředěná v RNase-free vodě a smíšená v poměru 1:1 na konečnou koncentraci 12 ng/µL (12 ng na kolonu) pro každý komponent.

Hlavní výsledky a diskuse

AMPcP jako sondní analyt:

Testy s AMPcP ukázaly, že Vanquish Amplify nabízí až dvojnásobnou citlivost v porovnání se systémy využívajícími MP35N průtokové komponenty za podmínek, kdy jsou sekundární kovové interakce nejvýraznější. Vliv pH mobilní fáze byl zásadní — kyselé podmínky (nižší pH) zvyšovaly sekundární interakce mezi fosfátovými skupinami a kovovým povrchem, což Amplify systém účinně potlačil.

Velká RNA (500 nt vs 5000 nt):

Porovnání Vanquish Amplify a Acquity Premier s identickými SurePac kolónami a stejnými detektory ukázalo: pro 5000 nt fragmenty byly signály obou systémů velmi podobné; pro 500 nt fragment byla na počátečních injekcích patrná výrazná výhoda Vanquish Amplify — téměř dvojnásobný počáteční peak height oproti systému s MP35N. Celkově Vanquish Amplify vykázal 1.25–1.35× vyšší intenzitu signálu pro velké RNA ve srovnání se systémy s MP35N, což ukazuje na nižší sekundární vazby a lepší citlivost při nižších koncentracích. Zatímco Acquity Premier vykazoval postupný kondiční efekt v sérii injekcí, Vanquish Amplify byl stabilnější a nevykazoval tento jev.

Diskuse:

Výsledky potvrzují, že inertní povrchy v průtokové cestě významně snižují sekundární interakce fosfodiesterových řetězců s kovem, což se projeví zejména u menších velkých RNA (500 nt) a u nízkých koncentrací. AMPcP jako sondní analyt potvrdil přítomnost kovově podmíněných interakcí a posloužil k rychlému srovnání systémů, přestože jeho chování není plně identické s dlouhými fosfodiesterovými řetězci RNA.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a signál intenzity umožňují snížení hmotnosti vzorku na kolonu, šetří materiál a usnadňují analýzu cenných nebo vzácných RNA vzorků.
• Nižší sekundární interakce znamenají lepší opakovatelnost a kvantitativní spolehlivost, klíčové pro QC metodiky v biotechnologii a farmaceutickém vývoji.
• Stabilnější chování bez výrazného kondičního efektu zrychluje validaci a zkracuje dobu potřebnou ke stabilizaci systému před analýzou.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj a širší adopce inertních průtokových povrchů a povlaků bude důležitý pro kvalitativní a kvantitativní analýzy mRNA a oligonukleotidových léčiv v průmyslovém nasazení.
• Integrace inertní UHPLC průtokové cesty s hmotnostní spektrometrií a automatizovanými platformami pro vyšší informační obsah a efektivitu QC workflow.
• Dále se očekává optimalizace mobilních fází (pH, ion-párující systémy) šitá na míru specifickým délkám RNA a typům modifikací, aby se minimalizovaly sekundární interakce bez ztráty chromatografické rozlišení.
• Standardizace testovacích sond (jako AMPcP) a protokolů pro posuzování inertnosti průtokových cest napomůže porovnání platforem mezi výrobci a laboratořemi.

Závěr

Studie ukazuje, že použití inertně upravených průtokových cest v UHPLC (Vanquish Amplify) významně snižuje sekundární kovové interakce u citlivých analy­tů a velkých RNA. To se projeví lepší citlivostí (až 2× u sondního AMPcP a 1.25–1.35× pro velké RNA oproti MP35N), stabilnějším chováním během sekvenčních injekcí a menší potřebou kondičního běhu. Pro analýzy RNA v nízkých koncentracích a pro náročné QC aplikace představuje inertní konfigurace průtokové cesty jasný přínos.

Reference

• Lovejoy K., Žvirblis A., Grübner M., Fehrenbach T., Steiner F. (2026). LC-UV analysis of large RNA using an inert UHPLC system (Technical Note No. 004606). Thermo Fisher Scientific.