Mind the pressure in preparative up-scaling – effects of particle size and solvent composition on back pressure

Význam tématu

Správné řízení zpětného tlaku je klíčové při vývoji a škálování HPLC metod pro preparativní purifikaci. Omezení maximálního tlaku na preparativních pumpách a jiných částech systému (ventily, kapiláry) může zablokovat lineární přenos analyticky optimalizované metody do větších průtoků. Porozumění vlivu velikosti částic, složení eluentu a průtoku na generovaný tlak umožňuje předpovídat a minimalizovat problémy při up‑scalingu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie zkoumá, jak ovlivňují tři hlavní parametry – velikost částic náplně kolony, průtok a složení mobilní fáze (acetonitril, methanol, ethanol v kombinaci s vodou) – generovaný zpětný tlak. Cílem bylo poskytnout praktická doporučení pro vývoj metod na analytické úrovni, která lze bezpečně převést na preparativní kolony.

Použitá metodika

Byly měřeny tlakové profily 150 x 4,6 mm C18 kolonek se čtyřmi různými velikostmi částic (5, 10, 15, 20/45 µm) při třech průtocích (1,0; 1,2; 1,4 ml/min) v lineárních gradientních bězích 5→100 % organické fáze pro směsi voda/acetonitril, voda/methanol a voda/ethanol. Pro každý experiment byl nejprve změřen tlak systému bez kolony a tento systémový tlak byl odečten, aby byl získán skutečný tlak generovaný kolonkou. Pro validaci přenositelnosti byla provedena lineární škálová konverze na preparativní kolonu 150 x 50 mm (10 µm) s odpovídajícím průtokem ~142 ml/min.

Použitá instrumentace

Analytická konfigurace (vybrané komponenty):

• Pumpa AZURA P 6.1 LHPG
• Autosampler AZURA AS 6.1L
• Detektor DAD AZURA DAD 2.1L
• Eurospher II C18 kolony: 150 x 4,6 mm v provedeních 5, 10, 15, 20/45 µm
• Software ClarityChrom

Preparativní konfigurace (vybrané komponenty):

• Pumpa AZURA P2.1L s LPG ternárním modulem
• ASM 2.2L jako asistenční modul
• Preparativní UV detektor a průtoková kyveta 1/16" (200 bar, 250 ml/min)
• Přepínací ventily 1/16", kapiláry 1/16" (ID 1 mm)
• Preparativní Eurospher II C18 150 x 50 mm, 10 µm
• Software PurityChrom

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní observační body:

• Velikost částic: Nejvýraznější snížení tlaku bylo pozorováno při přechodu z 5 µm na 10 µm částice. Menší částice generují výrazně vyšší tlak, přičemž 5 µm kolony vykazovaly nejvyšší hodnoty při všech podmínkách.
• Složení mobilní fáze: Porovnání tří organických rozpouštědel ukázalo konzistentní pořadí podle generovaného tlaku: ethanol > methanol > acetonitril. Pro acetonitril/woda byly tlakové křivky odlišné – maximum tlaku nastávalo přibližně při 30–35 % acetonitrilu a při 100 % ACN tlak prudce klesal (cca o 50 % oproti maximu). U methanolu a ethanolu se tlak zvyšoval postupně a dosahoval maxima kolem 50–60 % organiky, poté se tlak s další zvýšením podílu organiky snižoval (u ethanol/water zůstal na mírně vyšší hodnotě než při 5 %).
• Průtok a systémový tlak: Systém bez kolony přispíval významnou částí celkového tlaku (u analytických průtoků až ~16 bar). Je nezbytné systémový tlak změřit a odečíst pro získání skutečného tlakového profilu kolony.
• Škálování: Při lineárním up‑scale z 4,6 mm na 50 mm ID s udržením stejného poměru průtoku došlo k tomu, že preparativní kolona (150 x 50 mm, 10 µm) vykázala mírně vyšší tlak než analytická (přibližně o 4 bar). Důvodem může být rozdílné stlačení plniva při plnění preparativní kolony a úzké 1/16" připojení (menší průměr spojek než u analytiky), které zvyšuje hydraulický odpor při vyšších průtocích.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické implikace pro vývoj metod a škálování:

• Před metdou up‑scalingem vždy změřit systémový tlak bez kolony a odečíst jej – jinak hrozí podcenění reálného tlaku generovaného kolonkou.
• Volba velikosti částic je kompromisem mezi požadovaným rozlišením a maximálním povoleným tlakem preparativního systému; přechod z 5 na 10 µm často výrazně snižuje tlak při přijatelném snížení rozlišení.
• Při možnosti volby rozpouštědla preferovat acetonitril, pokud je cílem minimalizovat tlaky; ethanol vytváří nejvyšší tlaky a může rychle dosáhnout limitu pumpy/ventilů.
• Při lineárním škálování je možné předpovědět většinu tlakových charakteristik, avšak je třeba počítat s drobnými odchylkami (např. ~4 bar) způsobenými konstrukcí kolony a přípojek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a aplikace poznatků:

• Optimalizace plnění preparativních kolonek pro minimalizaci rozdílů v tlakovém profilu mezi analytikou a preparativou.
• Vývoj přípojek a ventilů s menším průtokovým odporem při vysokých průtocích (optimalizace 1/16" vs 1/8" vedení).
• Integrace tlakových modelů (vycházejících z Darcyova zákona) do softwaru pro automatizované plánování škálování metod a ověření kompatibility s limity preparativních systémů.
• Hledání alternativních mobilních fází nebo aditiv, které sníží viskozitu a tím i hydraulický odpor bez negativního vlivu na separaci.

Závěr

Studie demonstruje, že velikost částic, složení mobilní fáze a konstrukční detaily systému zásadně ovlivňují generovaný zpětný tlak. Systematické měření tlakových profilů na analytické úrovni s odečtením systémového tlaku poskytuje spolehlivou předpověď chování při lineárním up‑scale, přičemž určité praktické odchylky (např. mírně vyšší tlak na preparativě) je nutné očekávat. Volba větších částic a/nebo acetonitrilu jako organické fáze jsou efektivními opatřeními ke snížení zpětného tlaku při zachování použitelné separace.

Reference

Y. Krauke, U. Krop, K. Abraham; Mind the pressure in preparative up‑scaling – effects of particle size and solvent composition on back pressure; KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, verze 1, 06/2026.