Insight Profiler streamlines analysis of non-targeted metabolomics data from LCMS or direct injection in a single software solution

Význam tématu

Neřízená (non-targeted) metabolomika hraje klíčovou roli při hledání biomarkerů onemocnění, protože umožňuje komplexní profilaci malých molekul v biologických vzorcích bez předchozího omezení na předem definované cíle. V oblasti pankreatického adenokarcinomu (PDAC), kde včasná diagnostika významně ovlivňuje prognózu, je potřeba rychlých a škálovatelných screeningových metod pro identifikaci kandidátních biomarkerů. Kombinace vysoce výkonné hmotnostní spektrometrie a automatizovaného softwarového zpracování dat může významně zrychlit a zjednodušit objevné studie.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo demonstrovat schopnosti nového softwaru Insight Profiler pro automatizované zpracování non-targeted dat a jeho použití v pilotní studii hledání biomarkerů PDAC. Studie porovnávala profily sérových extraktů od pacientů s PDAC (n=30) a zdravých kontrol (n=30) získané dvěma přístupy: vysoce výkonným LC‑DIA‑MS/MS (LCMS‑9030 Q‑TOF) a rychlým direct probe ionization MS (DPiMS) bez chromatografie. Hlavním cílem bylo ukázat end‑to‑end workflow (detekce rysů, zarovnání, statistika, filtrování, anotace) v jediné metodě a ověřit shodu signálů mezi chromatografickým a direct‑injection přístupem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a schválení studie:

• Sérum: PDAC (n=30) vs. zdravé kontroly (n=30).
• Etika: schválení výzkumu Pancreatic Cancer Research Fund Tissue Bank.

Chromatografie a LC‑MS/MS podmínky:

• Kolona: C18 BEH (2.1×100 mm, 1.7 µm), teplota 50 °C, průtok 0.4 mL/min.
• Mobilní fáze: voda + 0,1 % kyseliny formiové / acetonitril + 0,1 % kyseliny formiové; binární gradient; doba cyklu 35 min.
• MS: TOF MS scan m/z 100–1500 s polarity switching; DIA‑MS/MS režim s 27 skeny (m/z 40–1000), izolace precursoru ~35 Da, collision energy spread 5–55 V, celkový cyklus <1 s.

DPiMS podmínky:

• Direct Probe Ionization MS (ambientní ionizace) pro rychlé profilování s minimální přípravou vzorku; pozitivní i negativní ionizace zaznamenána.
• Survey scan uveden jako TOF MS m/z 60–1000, 100 ms (uveden v metodice).

Instrumentace a software:

• LCMS‑9030 Q‑TOF (Shimadzu) pro LC‑DIA‑MS/MS.
• DPiMS v kombinaci s Q‑TOF pro direct injection analýzy.
• Insight Profiler (Shimadzu) jako jediná softwarová kaskáda: detekce rysů, zarovnání, statistická analýza (PCA, volcano plot), filtrace a identifikace sloučenin.
• Databáze pro identifikaci: interní metabolomická knihovna, MassBank, LipidBlast, HMDB.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Software Insight Profiler úspěšně zpracoval LC‑DIA‑MS/MS i DPiMS dataset v jednom nastavení metody, zahrnujícím detekci, zarovnání, statistiku a anotaci spekter.
• Byly identifikovány statisticky významné rozdíly v metabolitovém profilu PDAC vs. kontrola. Nejvýraznější změny se týkaly lipidního metabolismu: výrazné snížení fosfolipidů obsahujících linolovou kyselinu (např. LPC 18:2; PC 18:1_18:2; PC 18:2_18:2; PC 18:2_20:4) a dále snížení LPE 18:2, LPC 18:1, LPC 18:3 a LPC 20:5.
• Glutamát (glutamic acid) byl statisticky zvýšen v sérech PDAC pacientů.
• Významné rysy zjištěné v LC‑MS/MS byly opakovaně detekovatelné i v DPiMS datech; například ion s m/z 542.32218 (LPC 18:2) byl v DPiMS rovněž signifikantně nižší u PDAC.

Interpretace a omezení:

• Shoda mezi LC‑MS/MS a DPiMS ukazuje, že direct injection ambientní technika může sloužit jako rychlý screening k identifikaci kandidátních biomarkerů, avšak absence chromatografické separace zvyšuje riziko interferencí a izomerických překryvů.
• Identifikace je označena jako putativní na základě MS/MS a porovnání s knihovnami — vyžaduje potvrzení pomocí autentických standardů a případně cílené kvantifikace.
• Vzorek studie (n=30 vs. 30) je vhodný pro pilotní zjištění, ale pro klinické využití jsou nutné větší kohorty a validace napříč nezávislými soubory.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy Insight Profiler a kombinace technik:

• Centralizované zpracování: sjednocuje detekci rysů, zarovnání, statistiku a anotaci v jedné „method cascade“, což redukuje chyby přenosu dat mezi nástroji a zrychluje batch‑analýzy.
• Škálovatelnost: možnost aplikovat stejné zpracování na chromatografická i direct‑injection data zjednodušuje srovnání metod a rychlý pre‑screening pomocí DPiMS.
• Rychlý screening: DPiMS umožňuje výrazné zvýšení throughputu při minimální přípravě, vhodné pro předběžnou selekci kandidátů před nákladnou cílenou analýzou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směry dalšího rozvoje a aplikace:

1. Široká validace: rozšíření studie na větší, vícestřediskové kohorty a následná cílená kvantifikace (s interními standardy) k potvrzení potenciálních biomarkerů.
2. Integrace ion mobility a dalších separačních dimenzí ke snížení konfuzí izomerů v DPiMS režimu.
3. Využití strojového učení pro robustnější výběr signifikantních rysů a prediktivní modely kombinující LC a DPiMS data.
4. Rozvoj a obohacení knihoven (MS/MS) a validovaných referenčních standardů pro zvýšení jistoty identifikací.
5. Implementace DPiMS jako předběžného screeningového kroku před cílenými LC‑MS analytickými metodami v preklinických a klinických studiích.

Závěr

Insight Profiler představuje integrované řešení pro non‑targeted metabolomiku, které dokáže automatizovat celý zpracovatelský tok a aplikovat jednotné nastavení jak na LC‑DIA‑MS/MS, tak na DPiMS data. V pilotní studii PDAC vs. kontrola softwarový workflow odhalil konzistentní změny lipidního profilu (snížení fosfolipidů obsahujících linolát) a zvýšení glutamátu. DPiMS se ukázal jako slibný nástroj pro rychlý screening s odpovídajícími signály, avšak vyžaduje dodatečnou analytickou validaci. K dalšímu postupu patří rozšířené kohortové studie, cílená kvantifikace a potvrzení pomocí standardů před úvahou o klinickém využití.

Reference

• Insight Profiler software, Shimadzu Corporation (softwarové řešení pro non‑targeted analýzu).
• LCMS‑9030 Q‑TOF, Shimadzu (použité LC‑DIA‑MS/MS zařízení).
• Direct Probe Ionization Mass Spectrometry (DPiMS) jako ambientní direct‑injection technika (uvedeno v textu).
• MassBank (MS/MS databáze) - použitá k podpoře anotací.
• LipidBlast (MS/MS lipidní knihovna) - použitá k podpoře anotací.
• HMDB (Human Metabolome Database) - použitá k podpoře anotací.
• Pancreatic Cancer Research Fund Tissue Bank (PCRFTB) - schválení přístupu k vzorkům a etický souhlas studie.