A Comprehensive Dilute-and-Shoot Method for Creatine and Creatinine in Commercially Available Sports Nutrition Products Using a Single Quadrupole LCMS

Význam tématu

Creatin a jeho rozkladný produkt kreatinin jsou relevantní jak pro výživu sportovců, tak pro interpretaci klinických biomarkerů ledvinné funkce. Přítomnost kreatininu v potravinových a doplňkových matricích může ovlivnit označení složení produktu a potenciálně zkreslit hodnoty sérového kreatininu u spotřebitelů se zrychlenou absorpcí nebo metabolizmem. Jednoduché, rychlé a reprodukovatelné analytické metody pro kvantifikaci obou látek v komerčních produktech jsou proto důležité pro kontrolu kvality, bezpečnost spotřebitele a regulaci etiketace.

Cíle studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit jednoduchou „dilute-and-shoot“ metodu pro současnou separaci a kvantifikaci kreatinu a kreatininu v různých komerčních sportovních doplňcích (žvýkací tablety, gumy, pilulky, prášky a nápoje typu RTD) použitím jediného kvadrupólového LC–MS přístroje. Metoda měla pokrýt široký kalibrační rozsah, být citlivá (nízké LLOQ) a snadno aplikovatelná v rutinním prostředí.

Použitá metodika

Popis postupu a klíčové parametry:

• Přístup: diluce a přímé vstřikování (dilute-and-shoot) po homogenizaci vzorků ve vodě.
• Kalibrace: rozsah 0.005–100 ppm pro obě látky, interní standardy kreatin‑d3 a kreatinin‑d3, vážená lineární regrese (1/C^2), R2 > 0.999.
• LLOQ/LOD: 0.005 ppm pro obě sloučeniny; kritéria přesnosti a opakovatelnosti uvedena (S/N >3, %RSD <5%).
• Hodnocení recoveries: standardní přídavek ve třech úrovních (0.10, 1.00, 10.0 µg/mL); zjištěné recovery v rozmezí ~68.4–122 % přes všechny matice.
• Specifické poznámky o extrakci: pro gummy matice byla extrakce vodou efektivnější (61.5–75.9 %) než s 0.1 N HCl (24.1–30.2 %).

Použitá instrumentace

Seznam použitých přístrojů a parametrů:

• HPLC: Nexera (Shimadzu) se sloupcem Supelco Discovery HS F5 PFP, 3.0 µm, 2.1 × 150 mm.
• MS: Shimadzu LCMS‑2050, ESI v pozitivním módu.
• Mobilní fáze: A – voda s 0.1 % kyselinou mravenčí; B – methanol s 0.1 % kys. mravenčí.
• Vstřik: 1 µL; průtok 0.3 mL/min; gradient: B 35 % (0–1.5 min) → 95 % (4–5 min) → 35 % (5.01–8 min); celkový běh 8.0 min (včetně vysokého organického čistícího kroku proti carryover).
• ESI a plyny: nebulizační plyn 1.5 L/min, sušící plyn 3.0 L/min, ohřívací plyn 7.0 L/min; teplota desolvatace 450 °C; teplota desolvation line 200 °C.
• Optimalizované napětí: rozhraní nízké napětí – 1.00 kV pro kreatin, 0.50 kV pro kreatinin.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčová zjištění a interpretace:

• Chromatografie umožnila dostatečné rozlišení kreatinu a kreatininu s retenčním rozdílem přibližně 0.5 min; metoda byla rychlá (8 min běh) a robustní proti carryover díky high‑organic clean‑outu.
• Kalibrace vykazovala vynikající linearitu (R2 > 0.999) v rozsahu 0.005–100 ppm; LLOQ stanoven na 0.005 ppm.
• Recoveries podle standardního přídavku napříč matricemi byly široce proměnlivé (68.4–122 %), což indikuje maticové vlivy a nutnost interních standardů pro korekci.
• Praktická aplikace na pět komerčních vzorků: měřený obsah kreatinu se výrazně lišil od deklarovaného v některých případech – žvýkací tableta, gummy a pilulka obsahovaly méně kreatinu než deklarováno (relativní rozdíly ~‑96.4 %, ‑5.68 % a ‑23.3 %), zatímco prášek a RTD obsahovaly mírně více (+1.15 % a +6.44 %).
• Kreatinin, který nebyl na etiketách uváděn, byl detekován ve vzorcích žvýkací tablety (2.26 mg), gummy (46.1 mg) a zvláště ve vzorku RTD (1839 mg). Pilulka a prášek neobsahovaly detekovatelný kreatinin. To ukazuje, že rozklad kreatinu na kreatinin probíhá v závislosti na matrici a formulaci.
• Gummy ukázaly citlivé chování vůči extrakčnímu rozpouštědlu – voda poskytla lepší extrakční výtěžnost než kyselý roztok, což naznačuje formulaci vázanou na matrici a možnou citlivost kreatinu na pH při extrakci.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody a doporučení:

• Rychlá a jednoduchá metoda vhodná pro rutinní kontrolu kvality komerčních doplňků; nízký objem práce díky přístupu dilute‑and‑shoot.
• Použití interních izotopově značených standardů minimalizuje chyby způsobené maticovými efekty a variabilními recoveries.
• Metoda poskytuje citlivost potřebnou pro detekci nízkých hladin kreatininu, což je důležité pro bezpečnost a označování výrobků.
• Možnost rozpoznat produkty, kde dochází k nežádoucímu rozkladu kreatinu během skladování nebo v důsledku formulace (např. v tekutých RTD produktech).

Budoucí trendy a možnosti využití

Návrhy pro další rozvoj a širší aplikace:

• Rozšíření metodiky o LC–MS/MS nebo vysokorozlišovací MS pro potvrzující analýzu a lepší selektivitu v komplikovaných matricích.
• Sledování stability kreatinu v čase za různých podmínek (teplota, pH, zásobní materiály obalů) a vývoj formulací s nižším rizikem konverze na kreatinin.
• Automatizace přípravy vzorků a inkluze dalších formulací (např. energetické gely, kapsle s různými excipienty) pro širší kontrolu trhu.
• Implementace rutinních kontrol kvality u výrobců a distribučních řetězců, včetně návrhu limity přijatelných rozdílů oproti deklarovanému obsahu a limitů pro přítomnost kreatininu.
• Využití isotopových interních standardů a kvantitativních standardních přídavků pro validaci metod v souladu s regulačními požadavky.

Závěr

Byla vyvinuta rychlá a praktická single‑quadrupole LC–MS metoda pro současné stanovení kreatinu a kreatininu v komerčních sportovních doplňcích. Metoda nabízí široký kalibrační rozsah, dobrou linearitu a citlivost (LLOQ 0.005 ppm) a je vhodná pro rutinní kontroly. Aplikace na reálné vzorky odhalila významné rozdíly mezi deklarovaným a naměřeným obsahem kreatinu v některých produktech a nečekanou přítomnost kreatininu v několika matricích, zejména v tekutém RTD produktu. Tyto nálezy zdůrazňují potřebu pravidelné kontroly stability a přesnosti označení u výrobců sportovní výživy.

Reference

V původním dokumentu nejsou uvedeny samostatné literární odkazy. Autorský tým a financování: autoři jsou zaměstnanci a financováni firmou Shimadzu Corporation. Prezentované aplikace a produkty jsou určeny pouze pro výzkumné účely (RUO), ne pro diagnostické použití.