Enhanced LC-MS/MS Platform to Address Common Challenges During the Analytical Evaluation of Modern Peptide and Oligonucleotide Therapeutics

Význam tématu

Analýza moderních peptidových a oligonukleotidových terapeutik představuje pro farmaceutický výzkum rostoucí výzvu. Chemické modifikace a lipofility zvýšily biologickou účinnost těchto molekul, zároveň se ale zvýšila tendence k nešpecifickému vázání na kovové povrchy v UHPLC průtoku, vyššímu carryover, větší náchylnosti k in‑source fragmentaci při ESI a komplikacím v kolizní bunce. Současně rostoucí účinnost léčiv snižuje dosažené biologické koncentrace, což vyžaduje citlivější LC‑MS/MS workflows. Studie řeší praktické způsoby zvýšení citlivosti, snížení carryover a automatizace optimalizace MRM a zdrojových parametrů.

Cíle a přehled studie / článku

Záměrem bylo navrhnout a ověřit LC‑MS/MS postup, který sníží nespecifické vázání a carryover a zároveň zlepší citlivost při kvantifikaci čtyř lipofilních peptidů (semaglutid, liraglutid, tirzepatid, mazdutid) a referenčního siRNA duplexu (sense a antisense). Porovnán byl BioInert (XSInert) průtokový systém s tradičním nerezovým (SUS) průtokem za použití téhož tribolového triple quadrupole MS. Dále byla implementována automatizovaná optimalizace MRM a zdrojových parametrů pomocí softwaru LabSolutions Connect MRM.

Použitá metodika a instrumentace

• MS: Shimadzu LCMS‑8060RX (Triple Quadrupole).
• LC systémy: LC XSInert (BioInert flow path) a LC‑40 série (SUS/stainless‑steel flow path).
• Instrumentální software: LabSolutions pro sběr dat, LabSolutions Insight LCMS pro zpracování a LabSolutions Connect MRM pro automatizovanou optimalizaci MRM a zdrojových parametrů.
• Kolony: Shim‑pack Velox C18 2.7 μm, 2.1×100 mm a Scepter Claris C18‑300 1.9 μm, 2.1×150 mm (použití podle aplikace).
• Ionizace: ESI, pozice sondy +2 mm. Klíčové optimalizované parametry: CID gas pressure, Interface voltage, Focus voltage; ty měly největší vliv na intenzitu signálu.
• Mobilní fáze a chromatografie:
  • Peptidy: A = voda + 1% kyseliny formiové, B = acetonitril + 1% FA; průtok 0.3 mL/min; gradienty pro rychlé oddělení peptidů.
  • Oligonukleotidy: ion‑pairing systém s HFIP/TEA v aqueous fázi (50 mM HFIP, 16.3 mM TEA) a MeOH/H2O s 25 mM HFIP + 8.15 mM TEA pro jiný protokol; průtok 0.2 mL/min; metoda optimalizovaná pro separaci sense a antisense strandu siRNA duplexu.
• Vzorkování a příprava: směsi peptidů a ředěné duplexy siRNA v rozsazích připravených pro kalibraci (peptidy 0.1–1000 ppb; oliga: 0.015–1000 μM podle aplikační sady).

Hlavní výsledky a diskuse

• Snížení carryover: použití BioInert (XSInert) průtoku vedlo u peptidů k poklesu nespecifického carryover přibližně o 50 % v první blank injekci v porovnání se SUS průtokem; po třech blank injekcích bylo carryover <0,5 % u BioInert, zatímco u SUS byl stále patrný vyšší zbytkový signál.
• Zvýšení citlivosti pro peptidy: u čtyř lipofilních peptidů byla pozorována zvýšená signálová intenzita na XSInert, což vedlo k obecně nižším limitům detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ). Například pro semaglutid byl LOD na BioInert nižší než 0,1 ppb; pro ostatní peptidy byly LOD v řádu 0.1–0.25 ppb na BioInert, často lepší než na SUS.
• Oligonukleotidy: u testovaného siRNA duplexu nebyl mezi BioInert a SUS průtokem výrazný rozdíl v intenzitě signálu; senzitivita a LODy pro sense/antisense byly srovnatelné mezi oběma průtoky.
• Automatizovaná optimalizace MRM: použití Connect MRM výrazně urychlilo nastavení přechodů a zdrojových parametrů. Grafické výstupy umožnily identifikovat, že CID tlak, Interface a Focus napětí byly klíčové pro maximalizaci signálu napříč nabitými stavy peptidů a oligonukleotidů.
• Fragmentace a complicace: auto‑optimalizace rovněž pomohla minimalizovat problémy s in‑source fragmentací a komplikovanou kolizní fragmentací u více nabitých druhů.

Přínosy a praktické využití metody

• BioInert/XSInert průtokové řešení snižuje kov‑povrchovou interakci a tím carryover a ztráty analyzátu u lipofilních, vysoko nabitých peptidů — praktické pro PK/PD studie a bioanalytiku nízkonanomolárních koncentrací.
• Automatizovaná optimalizace MRM a zdrojových parametrů zkracuje čas vývoje metody a zvyšuje reprodukovatelnost nastavení, což je výhodné pro vyvíjející se analytické laboratoře a rutinní kvantitativní nasazení.
• Metoda je vhodná pro senzitivní kvantifikaci peptidových terapeutik ve farmaceutickém výzkumu, toxikokinetice a validaci bioanalytických metod, přičemž nabízí nižší LOQ/LOD a snížené riziko kontaminace mezi injekcemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dalsí rozvoj inertních průtokových cest a povrchových úprav (polymerní nebo pasivní vrstvy) směřuje ke snížení interakcí s analyty, zejména u vysoce nabitých a modifikovaných makromolekul.
• Pokračující automatizace optimalizačních kroků, včetně AI‑řízené volby přechodů a adaptivního ladění zdroje v reálném čase, může dále zkrátit dobu vývoje metod a zvýšit citlivost.
• Alternativní strategie pro ionizaci a separaci oligonukleotidů bez silných ion‑pair činidel (např. použití HILIC, anion‑exchange ve spojení s novými volatilními adjuvanty) mohou omezit složitost metod a vzájemné ovlivnění signálu.
• Implementace vysokokapacitních a mikroflow/nanoflow systémů pro zvýšení citlivosti a snížení spotřeby vzorku u velmi nízkých koncentrací bioterapeutik.
• Rostoucí integrace HRMS technologií pro potvrzení strukturálních variant a metabolitů oligonukleotidů a peptidů v nativním režimu.

Závěr

Shrnutí ukazuje, že kombinace inertního průtokového řešení (XSInert/BioInert) a automatizované optimalizace MRM přináší v analýze lipofilních peptidů měřitelný přínos: snížené carryover, zvýšená citlivost a rychlejší vývoj metod. U oligonukleotidů byl efekt méně patrný, což naznačuje, že optimalizace separace a ionizace u těchto analyzátů vyžaduje jiné strategie. Celkově tento workflow nabízí praktické vylepšení pro bioanalytiku moderních terapeutik.

Reference

• Allie Ferranti, Stephen Kurzyniec, Elizabeth Bloch, Vikki Johnson, Mark Lazari, Jacob Smith, Ethan Hain; Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD. MP‑560: Enhanced LC‑MS/MS Platform to Address Common Challenges During the Analytical Evaluation of Modern Peptide and Oligonucleotide Therapeutics. (prezentace/poster, autoři a financování od Shimadzu Corporation).
• Poznámka: Prezentované výsledky jsou určeny pro výzkumné účely (RUO). Nejsou určeny pro diagnostické použití.