Comprehensive Untargeted Metabolomic Analysis from Five Stages of Blueberry Development by High Resolution Accurate Mass Spectrometry

Komplexní netargetovaná metabolomická analýza pěti fází vývoje borůvky pomocí vysokorozlišovacího hmotnostního spektrometru

Význam tématu

Studium metabolomických změn v průběhu vývoje plodů borůvky je klíčové pro porozumění produkci bioaktivních sloučenin, optimalizaci pěstebních postupů a zajištění vysoké nutriční hodnoty produktů. Netargetovaný přístup umožňuje odhalit široké spektrum metabolitů, včetně těch hůře ionizovatelných nebo potlačených maticí, což zvyšuje šanci na identifikaci klíčových faktorů ovlivňujících kvalitu plodů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo porovnat, jak kombinace chromatografických režimů a režimů získávání MS/MS (DDA vs. DIA) ovlivňuje pokrytí metabolomu napříč pěti fenologickými stadii vývoje borůvky (Vaccinium corymbosum). Studie se zaměřila na rozšíření detekovaných metabolitů a na to, zda lze mezi vývojovými stadii rozlišit odlišné metabolomické profily.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: Borůvky z 4leté plantáže Texas A&M, odběr v pěti vývojových stadiích; extrakce a příprava vzorků podle publikovaných protokolů.
• Analýzy: Každý vzorek analyzován v trojitém provedení v náhodném pořadí; připravena sloučená QC vzorka (40 µL z každého jednotlivého vzorku) a analyzována opakovaně pro sledování stability.
• Chromatografie: Použity dvě komplementární separační techniky – reverzní fáze (RP) a hydrofobně-interakční chromatografie (HILIC) pro maximalizaci chemického pokrytí.
• MS režimy: ESI v pozitivním i negativním ionizačním režimu; sběr dat kombinací data-dependent acquisition (DDA) a data-independent acquisition (DIA), celkem 8 analytických metod (RP/HILIC × pozitivní/negativní × DDA/DIA).
• Databázové prohledávání: Souběžné vyhledávání proti třem knihovnám: MS-DIAL, EMBL a GNPS; vizuální porovnání experimentálních MS2 spekter s knihovními záznamy.

Instrumentace:

• LC: Shimadzu Nexera HPLC (Nexera X3 indikováno v textu pro reprodukovatelnost chromatogramů).
• MS: Shimadzu LCMS-9050 Q-TOF s ESI.
• Software: LabSolutions Insight Profiler pro zarovnání, extrakci funkcí, statistickou analýzu a vizualizaci (PCA, F-statistika, boxploty).

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost a kvalita dat:

• Overlay MS1 TIC pro čtyři opakované QC injekce ukázalo velmi dobrou reprodukovatelnost chromatografie pro oba módy (HILIC i RP), což potvrzuje stabilitu systému a přípravy vzorků.

Funkce a komponenty:

• Příklad analýzy HILIC DDA (pozitivní režim) přinesl 2384 zarovnaných funkcí a 1001 nalezených komponent, což ilustruje vysokou komplexitu extraktu.
• Obecně pozitivní režim generoval více funkcí a komponent než negativní režim; HILIC poskytl více funkcí než RP. DIA a DDA poskytly srovnatelný počet funkcí a komponent.

Identifikace pomocí knihoven:

• Více než 75 % shod z knihoven bylo pokryto kombinací HILIC DDA a RP DDA ve obou ionizačních módech, což naznačuje, že zrychlený protokol s těmito dvěma metodami může pokrýt většinu identifikovatelných metabolitů.

Multivariační analýzy:

• PCA analýzy u všech 8 analytických metod ukázaly konzistentní skupinování – zejména stadium 1 (nejranější fáze) se výrazně odlišovalo od ostatních stádií, což svědčí o významných metabolických změnách v počátečních fázích zrání.

Konkrétní metabolity:

• Příklady vybraných anotací (např. thiamin, sayaendoside) ukázaly rozdíly v relativním obsahu mezi stadii; některé metabolity byly silně zvýrazněné v raném stadiu, jiné vykazovaly plynulou změnu přes stádia.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Komplexní workflow kombinující HILIC a RP s DDA/DIA zvyšuje šanci na detekci širokého spektra metabolitů v rostlinných extraktech.
• Pro účely rychlého screeningu a omezení doby analýzy lze doporučit kombinaci HILIC DDA + RP DDA, která pokryje většinu identifikací při výrazném zkrácení instrumentálního času.
• Metodika je vhodná pro farmakognostiku, potravinářskou chemii, šlechtění a kontroly kvality, kde je důležitá detailní charakterizace metabolického profilu v různých vývojových stádiích.

Metodologické důsledky:

• Výsledek podtrhuje potřebu více chromatografických režimů a obou ionizačních módů při netargetovaném přístupu, aby se minimalizovaly ztráty informací způsobené selektivní ionizací nebo matičními efekty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciální rozvoj a aplikace:

• Rozšíření knihoven MS/MS a standardizace anotací zvýší spolehlivost identifikací a umožní hlubší biologickou interpretaci.
• Doplnění metod o ion-mobility separaci a vyšší rozlišení časové separace by mohlo zlepšit rozlišení izobarických a konformačních forem.
• Integrace kvantitativních workflow (s interními standardy) by umožnila robustnější komparace koncentrací metabolitů mezi stadii a podmínkami pěstování.
• Využití strojového učení pro automatizovanou anotaci a predikci biologicky relevantních markerů by zrychlilo interpretaci rozsáhlých datových sad.

Možnosti nasazení v praxi:

• Optimalizace sklizně a zpracování plodů na základě metabolomických markerů.
• Podpora šlechtitelských programů zaměřených na zvýšení obsahu antioxidantů a jiných bioaktivních sloučenin.

Závěr

Studie ukázala, že kombinované použití HILIC a RP chromatografie spolu s DDA a DIA režimy na LCMS-9050 Q-TOF poskytuje komplexní netargetované pokrytí metabolomu borůvky. Všech pět analyzovaných vývojových stádií má odlišné metabolomické profily, přičemž nejranější stadium se nejvíce liší. Pro praktické, časově úsporné aplikace stačí kombinace HILIC DDA a RP DDA k nalezení většiny porovnatelně identifikovatelných metabolitů.

Reference

1. Das PR, Darwish AG, et al. Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity. Food Chemistry. 2022;374:131632. doi:10.1016/j.foodchem.2021.131632.