Screening Metabolomics of Human Urine Using a Waters™ High Resolution QTof Mass Spectrometer and MARS Data Processing Software

Význam tématu

Metabolomika poskytuje komplexní pohled na biochemické změny organismu vlivem onemocnění, léčby, expozice nebo životního stylu. Analýza moči je neinvazivní a odhaluje tisíce nízkomolekulárních metabolitů se širokým rozsahem polarity, hmotnosti a koncentrace. Kombinace HILIC UPLC, vysoce přesné hmotnostní spektrometrie (HRMS) a workflow-orientovaného softwaru MARS umožňuje rychlé a reprodukovatelné screeningové studie na velkých souborech vzorků.

Cíle a přehled studie

Studie sledovala tři skupiny lidských močí založené na příjmu nikotinu: nekuřáci, pasivně exponovaní a aktuální kuřáci. Použit byl standardizovaný NIST SRM 3671 soubor, vzorky byly smíchány do tří „master“ sad a dále zpracovány včetně QC poolu. Cílem bylo demonstrovat robustnost akvizice na Xevo G3 QTof a efektivitu softwaru MARS pro detekci, identifikaci a pathway profilování metabolitů.

Použitá instrumentace

• ACQUITY I-Class Premier FTN s kolonkou BEH Amide (1,0 mm×50 mm, 1,7 µm)
• Xevo G3 QTof hmotnostní spektrometr (MSE kontinuum, 50–1200 Da, 10 Hz)
• waters_connect platforma pro řízení akvizice
• MARS Software (Mass Analytica) pro zpracování LC-MS dat

Použitá metodika

Vzorky moči rozředěné a spiked QC standardem prošly pětinásobnou replikací analýzy (1 µL injekcí) s gradientem HILIC (0,03–3,5 min). MS parametry: pozitivní ionizace, tepelná desolvatace 600 °C, StepWave XS, MSE režim s energií 20–40 eV. Data importována do MARS, kde proběhlo:

• Baseline a šumová redukce, detekce piků, vyhlazení, RT korekce a alignace do jedné super-vzorkové chromatogramové matice
• Statistické zpracování (PCA, PLS-DA, S-plot) pro zobrazení rozlišení skupin
• Putativní identifikace přes HMDB, MoNA a in-house databáze s hodnocením podle hmotnostní odchylky, izotopového vzorce, MS/MS a případně CCS
• Semi-kvantifikace kalibračními křivkami a klastrování trendů
• Mapování do biochemických cest (např. metabolismus tyrosinu)

Hlavní výsledky a diskuse

• Výborná stabilita retence a hmotnostní přesnost ±5 ppm, dynamický rozsah až 5 řádů
• PCA jasně rozlišila tři úrovně nikotinu s QC vzorkem ve středu
• Přibližně 6000 putativně identifikovaných znaků; vysokou spolehlivost ≥80 bodů barevně odlišenou
• Detekce a vyřazení kokainových metabolitů pomocí in silico modulu
• Trendová analýza odhalila skupinově specifické metabolity, např. tyramin či benzoylecgonin
• Pathway profiling ukázal klíčové biochemické dráhy ovlivněné kouřením

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a reprodukovatelný screening rozsáhlých studií metabolomiky
• Integrované workflow od akvizice po cestovní profilování
• Možnost přizpůsobení parametrů dle aplikace a multiplatformní kompatibilita
• Podpora QA/QC konzortiem mQACC pro zvýšení kvality dat

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace IMS (ion mobility) pro lepší rozlišení izomerů
• Využití strojového učení pro automatizovanou anotaci a validaci biomarkerů
• Rozšíření databází CCS a MS/MS pro vyšší identifikační jistotu
• Personalizovaná medicína: sledování metabolických odchylek v klinických studiích

Závěr

Kombinace HILIC-UPLC na ACQUITY Premier, vysoce přesné HRMS na Xevo G3 QTof a workflow-řízeného softwaru MARS představuje ucelené řešení pro screeningovou metabolomiku lidské moči. Metoda nabízí rychlou akvizici, robustní statistické vyhodnocení a spolehlivou identifikaci metabolitů, což umožňuje detailní pohled na biochemické změny spojené s expozicí nebo nemocí.

Reference

1. Reproducibility and Robustness of the Xevo G3 QTof Mass Spectrometer for the Analysis of Large Cohort Studies. Waters Application Note. 720008274. 2024.
2. Beger RD, et al. Towards Quality Assurance and Quality Control in Untargeted Metabolomics Studies. Metabolomics. 2019;15(1):4.
3. Evans AM, et al. Dissemination and Analysis Of the QA/QC Practices Of LC-MS Based Untargeted Metabolomics. Metabolomics. 2020;16(10):113.
4. Goracci L, et al. MARS: A Multipurpose Software for Untargeted LC–MS-Based Metabolomics and Exposomics. Anal. Chem. 2024;96(4):1468–1477.
5. Wishart DS, et al. HMDB 5.0: the Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D622–D631.