Integrated tools for scripted automation of tuning, review and analysis pipelines

Význam tématu

Automatizace vývoje a správy cílených LC/MS metod je klíčová pro zvýšení produktivity, konzistence a škálovatelnosti analýz při rostoucím počtu analyzovaných látek. Integrace řízených cyklů akvizice, zpětné analýzy a optimalizace parametrů umožňuje efektivně využít pokročilé funkce hybridních hmotnostních spektrometrů (Stellar MS), zejména pro MS2/MS3 módy a různé typy aktivace (HCD, CID). To má přímý dopad na dosažitelné limity kvantifikace (LOQ), selektivitu a reproducibilitu v aplikacích od proteomiky po analýzu malých molekul, např. drogových panelů v krevní plazmě.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem prezentované práce bylo demonstrovat koncept platformy Acquisition Composer, která řídí iterativní smyčky pre-acquire / acquire / post-acquire v LC/MS workflow. Studie se zaměřila na automatizovanou optimalizaci parametrů MS2 a MS3 a na hodnocení dopadu volby typu aktivace a energie srážek na signál a LOQ pro tři aplikační soubory: ProteomEdge DE175 peptidový kit, panel 32 běžných drog v krátké 5minutové metodě a 393-peptidový plasmatický kit.

Použitá metodika a instrumentace

• Software a workflow: Acquisition Composer pro řízení iterativních akvizičních cyklů; Skyline CLI pro extrakci dat z raw souborů; Python skripty pro analýzu výsledků a selekci optimálních přechodů.
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Stellar MS (hybridní kvadrupól – radiální ejekční lineární iontový past), použití MS2 a MS3 režimů s HCD a rezonantním CID aktivacemi.
• Chromatografie: Přenos metod mezi systémy Evosep a Thermo Vanquish (Vanquish Neo/Horizon). Použité kolony: ES75150PN a srovnatelné 75 µm x 150 mm konfigurace.
• Standarty a soubory: ProteomEdge Discovery Edge (DE175) 96-jamkový kit s qRePS (těžce značené peptidy), panel 32 drog, PRTC menší studie pro volbu MS3 parametrů.
• Experimentální přístupy: sériované LC injekce s variací typu aktivace a normalizované kolizní energie (NCE) pro určení optimálních podmínek; post-akviziční úprava a optimalizace analyzačních přechodů pro dosažení nejnižších LOQ; vytváření dilučních křivek pro porovnání výkonu MS2 vs. MS3.

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptidová část (DE175): Optimální NCE pro resonate CID byla ~30 % (2 ms aktivace, q=0,25) a pro collision-cell HCD ~25 %. HCD dávalo vyšší signál u ~62 % peptidů; rozdíly mezi aktivacemi byly většinou řádově kolem 20 %.
• V průměru byla zjištěna lepší citlivost při snížení výchozí HCD energie z 30 % na ~22 %, což vedlo ke zvýšení signálu v průměru o ~35 %.
• MS3 vs. MS2 u peptidů: po výběru nejlepší aktivace pro každý peptid vedla optimalizace k ~2,5× nižším LOQ ve srovnání s původním MS2 HCD nastavením; u ~70 % peptidů MS3 poskytlo stejné nebo lepší LOQ než MS2, a u ~40 % bylo MS3 jednoznačně lepší.
• Drogy malých molekul: optimální typ aktivace pro MS2 byl v populaci rozdělený; pro MS3 často vedly kombinace HCD/HCD nebo CID/CID k nejvyšším signálům. Výběr nejlepšího MS3 nastavení pro každou látku přinesl až ~6,3× zlepšení LOQ vs. MS2 HCD. Celkově u 84 % látek MS3 poskytlo stejné nebo lepší LOQ než MS2 a u 48 % bylo MS3 lepší.
• Praktické příklady: pro některé analyty (např. zolpidem) MS3 přineslo výrazné zlepšení selektivity a analytických parametrů, což ukazuje hodnotu MS3 pro složité matice a interferenční okolnosti.
• Transferability: přenos metody z Evosep na Vanquish byl realizovatelný díky stanoveným očekávaným retenčním časovým trendům; lokalizované odchylky byly často vysvětlitelné nepřítomností některých peptidů (např. missed-cleavages).

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované workflowy urychlují a standardizují vývoj cílených metod tím, že automaticky testují mnoho kombinací akvizičních parametrů a volí optimální podmínky pro jednotlivé látky.
• Integrace Skyline CLI a skriptovatelné analýzy umožňuje rychlé post-acquisition filtrování spekter a selekci přechodů, čímž se zkracuje čas potřebný k dosažení nízkých LOQ a robustních přechodů.
• MS3 režimy přinášejí významné výhody v selektivitě a citlivosti u mnoha malých molekul a v některých případech výrazně snižují LOQ, což je důležité pro toxikologii, klinickou analýzu a forenzní aplikace.
• Přenositelnost metod mezi LC systémy zvyšuje flexibilitu laboratoří při přechodu na odlišné platformy bez zásadní ztráty výkonu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření Acquisition Composer o uživatelské rozhraní a plně integrované workflowy (včetně Expert Review a QC-trigger akcí) pro širší nasazení v rutinních laboratořích.
• Další rozvoj automatizované, peptid-specifické optimalizace MS3 parametrů a testování širších Q1 izolačních šířek pro zlepšení selektivity a citlivosti.
• Škálování na velké panely cílových analytů a hlubší integrace s LIMS a systémy správy kvality pro rutinní nasazení v klinickém a forenzním prostředí.
• Využití pokročilých algoritmů pro automatickou klasifikaci optimálních aktivací a energie (strojové učení) na základě strukturálních nebo spektrálních vlastností analyzátů.

Závěr

Acquisition Composer demonstruje, že programovatelná automatizace iterativních akvizičních cyklů spolu s nástroji pro masivní post-akviziční zpracování (Skyline CLI, skripty) umožňuje efektivní optimalizaci MS2 a MS3 parametrů. U peptidů i malých molekul vedla optimalizace k významnému zlepšení signálu a snížení LOQ; zvláště u panelu drog MS3 často přineslo markantní výhodu. Platforma tak nabízí cestu ke škálovatelné, reprodukovatelné a vysoce selektivní cílené analytice v komplexních maticích.

Reference

1. Remes PM, Shulman N, Jacob CC, et al. Hybrid quadrupole mass filter – radial ejection linear ion trap and intelligent data acquisition enable highly multiplex targeted proteomics. Journal of Proteome Research. 2024;23(12):5476-5486.
2. Kotol D, et al. Targeted proteomics analysis of plasma proteins using recombinant protein standards for addition only workflows. Biotechniques. 2021;71(3):476-483.