Unlocking the archived proteome: High-throughput, deep FFPE proteome profiling using the Orbitrap Astral Mass spectrometer

Profilace proteomu z FFPE vzorků pomocí Orbitrap Astral Mass spectrometer

Význam tématu

Formaldehydem fixované a parafinem zapečetěné (FFPE) tkáňové bloky představují zásadní zdroj klinického materiálu pro retrospektivní studium, objev biomarkerů a translaci do kliniky díky široké dostupnosti a dlouhodobé archivaci. Nicméně chemické crosslinkování a parafinová matrice komplikují extrakci a trávení proteinů, což dosud omezovalo hloubku, reprodukovatelnost a průchodnost proteomických analýz. Optimalizované, škálovatelné metody, které zvládnou nízké vstupy a rychlé LC–MS běhy, jsou proto klíčové pro využití biobankovaných FFPE vzorků v masivních studiích a diagnostice.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo představit zjednodušený, rychlý a robustní pracovní postup pro proteomiku FFPE tkání kombinovaný s vysokovýkonným Orbitrap Astral mass spektrometrem a automatizovaným OptiSpray ion source. Studie demonstrovala schopnost workflow dosáhnout hlubokého profilování proteomu z plicních nádorových a normálních FFPE bloků při různých průtocích analytického času (60, 180, 500 SPD – samples per day) a s nízkými on-column náložemi (20–200 ng). Důraz byl kladen na dosažení vysoké hloubky identifikací, nízké variability a škálovatelnosti pro biomarkerové a diferenční analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Deparafinizace: xylén a postupné ethanoly.
• Extrakce a trávení: optimalizovaný protokol s použitím EasyPep Mini MS sample prep kitu pro zlepšení výtěže peptidů z FFPE řezů.
• Kvantifikace: Pierce Rapid Gold BCA pro proteiny a Pierce Fluorometric Peptide Assay pro peptidy.
• LC separace: přímá injekce (direct injection) při 55 °C na Vanquish Neo UHPLC systému s Thermo Scientific OptiSpray µPAC Neo 50 cm cartridge (pro 60 SPD, 20 min) a µPAC Neo High-Throughput cartridge (pro 180 SPD, 6.8 min). Pro velmi vysokou propustnost (500 SPD, ~2.3 min) byly použity Evosep ENO workflow a Evosep EV1182 Performance Column při 40 °C a EvoTips pro naložení peptidů.
• Akvizice: Orbitrap Astral mass spektrometr (DIA režim), parametry nastavené pro vysoké rozlišení MS1 (240k), různé izolační okna a adaptované AGC/Max-IT hodnoty podle throughputu a vstupního množství peptidů.
• Datová analýza: Biognosys Spectronaut v režimu directDIA pro zpracování surových DIA souborů; další statistika, vizualizace a diferenciální analýzy provedeny v R (RStudio).

Klíčová instrumentace:

• Orbitrap Astral Mass spectrometer (Thermo Scientific)
• OptiSpray µPAC Neo cartridge (50 cm) a µPAC Neo High-Throughput cartridge (Thermo Scientific)
• OptiSpray Ion source (automatizovaný) pro snížení kontaminace
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System
• Evosep ENO workflow a Evosep EV1182 Performance Column (pro 500 SPD)
• Thermo Scientific EasyPep Mini MS sample prep kit
• Thermo Scientific Pierce Rapid Gold BCA a Pierce Fluorometric Peptide Assay
• Spectronaut (Biognosys) a R/RStudio pro downstream analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

Hluboké pokrytí proteomu:

• Z 200 ng vstupu při 20 minutové separaci (60 SPD) bylo identifikováno přibližně 8 500 proteinových skupin a více než 100 000 peptidů, což ilustruje vysokou hloubku detekce z FFPE materiálu.
• Velmi vysoká propustnost (500 SPD, ~2 min gradient) umožňuje identifikaci ~3 700 proteinů z 20–200 ng vstupu, tedy zachování stěžejné části proteomu i při extrémně rychlých bězích.

Reprodukovatelnost a citlivost:

• Workflow udržuje vysokou kvantitativní reprodukovatelnost s mediánem CV ≤10 % i při nízkých vstupech (20 ng) a napříč akvizičními rychlostmi.
• Korelace rozdílových měr mezi delšími a kratšími gradienty byla vysoká (r ~0.93 pro 180 vs 60 SPD; r ~0.87 pro 500 vs 60 SPD), což ukazuje konzistentní biologické signály napříč throughput režimy.

Biologické zjištění:

• Workflow umožnil odhalit proteiny významně obohacené v nádorových versus normálních plicních tkáních a identifikovat nejvíce reprezentované KEGG dráhy v nádorově obohacených proteinech.
• Diferenciální expresní analýzy byly robustní i při rychlých bězích, což podporuje použití metody pro škálované srovnávací studie.

Praktická poznámka k kompromisu mezi hloubkou a propustností: přechod z 60 SPD na 180 SPD zachovává přibližně 70 % proteomové hloubky, zatímco 500 SPD zachovává kolem 45 %; tento kompromis je přijatelný pro studie zaměřené na průzkum a vysoké škálování.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost: end-to-end zpracování FFPE vzorku do výsledků v rámci jednoho dne – vhodné pro vysoce propustné studie a případnou klinickou aplikaci.
• Škálovatelnost: volba gradientu a platformy (Vanquish Neo vs Evosep) umožňuje přizpůsobit poměr hloubky vs počtu vzorků dle projektu.
• Nízký vstup: citlivost při 20 ng na kolonu otevírá možnost práce s omezeným materiálem, např. malými biopsiemi.
• Robustnost: OptiSpray automatizovaný ion source snižuje znečištění a zvyšuje stabilitu provozu při dlouhodobém nasazení.
• Analytické využití: metoda podporuje identifikaci biomarkerových signálů, diferenční proteomiku, dráhové analýzy a retrospektivní studie s bohatými klinickými kolekcemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s prostorovou proteomikou a imunohistochemickými daty pro kontextualizaci lokální exprese v tkáňových mikromilích.
• Další zvyšování propustnosti bez výrazné ztráty biologické informace díky optimalizaci databázových strategií a algoritmů pro DIA (strojové učení pro lepší dekonvoluci signálů).
• Vyšší integrace automatizovaných přípravných linek pro minimalizaci variability uživatele a větší standardizaci pro multi-center studie a klinické validace.
• Rozšíření aplikací na fosfoproteomiku a další PTM analýzy z FFPE vzorků při zachování propustnosti.

Závěr

Prezentované workflow kombinuje optimalizovanou přípravu FFPE vzorků s vysokovýkonnou LC–MS akvizicí na Orbitrap Astral a automatizovaným OptiSpray zdrojem, čímž dosahuje hlubokého, citlivého a reprodukovatelného profilování proteomu z archivovaných tkání. Metoda nabízí flexibilní kompromis mezi hloubkou a propustností, umožňuje spolehlivou diferenciální analýzu a je použitelná pro velké kohortní studie i pro výzkumné projekty s omezeným materiálem. Nasazení této strategie může významně urychlit translaci proteomických biomarkerů z biobank do klinických aplikací.

Reference

1. Haines M. et al. High-throughput proteomic and phosphoproteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Molecular & Cellular Proteomics, 24, (2025).
2. Zhu Y. et al. High-throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification. Molecular Oncology 13, 2305–2328 (2019).
3. Wang Y. et al. Effects of tumor metabolic microenvironment on regulatory T cells. Molecular Cancer, 17 (2018).
4. Liu Y., Vandekeere A., Xu M., Fendt S. M. & Altea-Manzano P. Metabolite-derived protein modifications modulating oncogenic signaling. Frontiers in Oncology, 12 (2022).