PTM Analysis using HCD and EThcD on an Orbitrap Excedion Pro Mass Spectrometer

Význam tématu

Proteinové posttranslační modifikace (PTM) významně ovlivňují funkci, lokalizaci a stabilitu proteinů a jsou klíčové v buněčné signalizaci i v patofyziologii chorob. Vzhledem k jejich často nízké zastoupenosti, prostorové a časové dynamice vyžaduje analytika PTM vysokou citlivost, rychlost a přesnost lokalizace modifikačních míst. Hmotnostní spektrometrie s pokročilými režimy fragmentace představuje výkonný nástroj pro komplexní analýzu PTM z obohacených vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat výkon kolizně indukované (HCD) a kombinované elektronové/kolizní fragmentace (EThcD) při analýze PTM-obohacených peptidů na novém Orbitrap Excedion Pro hmotnostním spektrometru. Studie hodnotí citlivost, rychlost, míru identifikací a schopnost lokalizace modifikačních míst napříč různými typy PTM: celková fosforylace (IMAC), fosfotyrosinové peptidy (PTMScan), asymetrická dimetylargininace (ADMA) a O-glykosylace.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup zahrnoval:

• Vzorky: HCT116 lidské kolorektální buňky, homogenáty myší jater a mozku; proteiny štěpeny trypsinem nebo LysC.
• Enrich­ment: IMAC pro globální fosforylaci; PTMScan® sady (Cell Signaling Technology) pro fosfotyrosin, ADMA a O-GlcNAc.
• LC: Vanquish Neo UHPLC se sloupcem IonOpticks Aurora® Ultimate 25×75 XT C18.
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro s podporou HCD a ETD; DDA režim s automatickým optimalizováním kolizní energie a ETD reakční doby pro jednotlivé prekurzory.

Fragmentační režimy: porovnání klasického HCD, ETD s doplňkovou energii (EThcD) a aktivovaných strategií jako oxonium ion-triggered EThcD (pro glykozylaci) nebo stepHCD pro některé aplikace.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy shrnuté takto:

• Globální fosfoproteom (IMAC): identifikováno přibližně 5890 unikátních fosfositeů; distribuční analýza ukázala dominanci fosfoserinů (~92 %) a velmi nízký podíl fosfotyrosinů v IMAC-enrichovaných vzorcích (pouze několik desítek).
• Fosfotyrosinová analýza (PTMScan): po specifickém obohacení detekováno přes 2900 unikátních fosfotyrosinových lokalizací; jak HCD, tak EThcD poskytly značný počet identifikací, přičemž některé lokusy byly zjištěny pouze jedním z režimů.
• Porovnání výsledků (phospho PTMScan): HCD v této sadě generovalo více detekovaných proteinů a peptidů (např. ~3008 proteinů, ~12 879 peptidů, ~16 855 PSM), zatímco EThcD poskytl nižší celkové počty, ale stále vysokou míru lokací fosfopeptidů (např. ~2493 proteinů, ~11 130 peptidů, ~14 257 PSM).
• ADMA (asymetrická dimetylargininace): obohacení vedlo k detekci téměř 300 ADMA míst; HCD identifikovalo více celkových peptidů, ale EThcD přinesl více PSM a více unikátních ADMA lokalizací — tedy lepší hloubku pro tuto modifikaci.
• O-glykosylace: O-glykanové modifikace jsou během kolizní fragmentace labilní; EThcD a oxonium ion-triggered EThcD významně zlepšily pokrytí fragmenty a umožnily spolehlivou lokalizaci O-glykanů. Příklady (PCLO, ARHGEF5) ilustrují, že HCD nebo stepHCD mohou dát dostačující sekvenční pokrytí, ale bez EThcD často není možné určit správné pozice modifikací.
• Komplementarita metod: HCD a EThcD se vzájemně doplňují — kombinace poskytuje širší sadu identifikací a vyšší jistotu lokalizace PTM oproti použití pouze jedné fragmentační strategie.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy nasazené metodiky:

• Orbitrap Excedion Pro s ETD nabízí flexibilní platformu pro komplexní analýzu PTM, zvláště tam, kde jsou modifikace labilní nebo je potřeba spolehlivá lokalizace míst.
• Automatické optimalizování kolizních energií a ETD časů v DDA umožňuje snadnější nastavení metod a konzistentní kvalitu dat napříč prekurzory.
• Vysoká orbitrapová přesnost zvyšuje důvěru v identifikace a lokalizace, usnadňuje analýzu PTM-obohacených vzorků s širokým dynamickým rozsahem.
• Praktické aplikace: výzkum signalizace (fosforylace, fosfotyrosin), biomarkerová identifikace v kardiometabolických onemocněních (ADMA), studium glykoproteomiky (O-glykany) a další PTM- studia v základním i translačním výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a využití v praxi:

• Integrace více fragmentačních režimů (HCD, EThcD, reakční režimy spouštěné oxonium iony) v rutinních pracovních postupech pro komplexní mapování PTM.
• Rozvoj cílených metod (PRM/SRM) založených na objevových DDA datech pro přesnější kvantifikaci klíčových PTM v klinických studiích.
• Vylepšené softwarové nástroje a algoritmy pro lokalizaci modifikačních míst využívající vysokou orbitrapovou přesnost a bohatá fragmentační spektra z EThcD.
• Širší aplikace v glykoproteomice a dalších labilních modifikacích díky oxonium-trigger a hybridním fragmentačním strategiím.

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace HCD a EThcD na Orbitrap Excedion Pro poskytuje robustní a flexibilní přístup k analýze PTM-obohacených vzorků. HCD generuje vysoký počet celkových identifikací, zatímco EThcD často zlepšuje pokrytí sekvence a spolehlivost lokalizace modifikací, zejména pro labilní PTM jako O-glykosylace nebo pro přesné přiřazení pozic v polohy s více potenciálními modifikacemi. Automatické optimalizace fragmentačních parametrů a vysoká orbitrapová přesnost přispívají k vysoké kvalitě dat a usnadňují implementaci metod v laboratorní praxi.

Reference

1. Riley, N. M.; Malaker, S. A.; Driessen, M.; Bertozzi, C. R. Journal of Proteome Research 2020, 19 (8), 3286–3301.