High throughput targeted proteomic workflows with Adaptive Retention Time on the Orbitrap Astral Zoom MS

Význam tématu

Rychlé a spolehlivé cílené proteomické metody jsou klíčové pro validaci biomarkerů a jejich přenos do rutinních laboratorních aplikací. S rostoucím důrazem na velké kohortní studie je nutné zvýšit propustnost (samples per day, SPD) při zachování přesnosti kvantifikace. Krátké chromatografické gradienty vedou k užším vrcholům a vyšší hustotě peptidů, což zvyšuje citlivost metod na posuny retenčních časů (RT). Adaptivní korekce RT v reálném čase umožňuje zúžit plánovací okna pro cílené akvizice a tím zvýšit kapacitu a spolehlivost cílených pracovních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je ověřit schopnost adaptivního nezávislého času zadržení (adaptive RT, aRT) v kombinaci s vysokorychlostním Orbitrap Astral Zoom hmotnostním spektrometrem k provádění rozsáhlého cíleného proteomického screeningu při vysoké propustnosti (až 300 SPD). Studie zkoumá robustnost aRT vůči různým zdrojům RT posunů, měří schopnost zachytit tisíce targetů s úzkými akvizičními okny a hodnotí hybridní režim, který kombinuje cílené MS2 a úzkopásmové DIA pro souběžné získávání cílených a objevních dat.

Použitá metodika a instrumentace

Pečlivě navržené experimenty využívaly referenční a následné akvizice pro získání referenčních spekter a RT cílů. Hlavní kroky metodiky zahrnují:

• Získání referenčních dat pomocí MS1 a/nebo širokopásmového DIA.
• Průběžné „alignment“ aRT skeny (MS1 nebo široké DIA) během cílené akvizice.
• V reálném čase prováděnou křížovou korelaci současných alignment skenů s referenčními spektry k odhadu posunu RT a dynamické přeprogramování plánovaných oken pro cílené MS2.

Použitá instrumentace a materiály:

• Orbitrap Astral Zoom MS (Thermo Scientific) — vysoká rychlost MS2 a paralelizace analýzy.
• Thermo Vanquish Neo UHPLC a 15 cm Thermo PepMap analytické kolony (150 µm ID).
• Softwarové nástroje: Spectronaut pro analýzu DIA a generování target listů, Skyline pro validaci a export RT u menších sad.
• Samply: Pierce HeLa protein digest (200 ng injekce) a lidské plazmové vzorky (jednotlivé i poolované) pro testování matrice.
• Pro hybridní režimy kombinace úzkopásmového DIA a cílených MS2 akvizic s adaptivním RT.

Hlavní výsledky a diskuse

• aRT spolehlivě kompenzovalo RT posuny způsobené různými faktory, včetně matrice plazmy, výměny kolony/samplovací linky a silně degradované kolony nebo experimentálně indukovaných změn průtoku.
• Při propustnosti 300 SPD bylo možné využít velmi úzká cílená okna (<15 s) díky adaptivnímu zarovnání, což výrazně zvyšuje počet paralelně sledovatelných targetů oproti statickým oknům (např. 30 s) bez aRT.
• V rozsáhlých testech bylo dosaženo vysoké obnovitelnosti targetů: pro sady o velikosti ~979, 1900 a 2715 targetů byly nalezeny více než 98 % cílových peptidů; medián truncation (prořezání vrcholů) byl nízký (~0.4–1.1 %), přičemž většina targetů vykazovala <10 % truncation.
• Hybridní DIA (kombinace úzkopásmového DIA a cílených MS2 akvizic řízených aRT) umožnila zařadit až ~1000 targetů s minimálním vlivem na „hloubku“ DIA: pokles v počtu proteinových skupin byl <2 % a pokles počtu peptidů přibližně 13 % v porovnání s čistým nDIA.

Diskuse: výsledky ukazují, že aRT zlepšuje spolehlivost šírokých a rychlých workflow tím, že umožňuje udržet úzká plánovací okna i při RT variabilitě, čímž se zvyšuje kapacita a citlivost cílených kampaní bez zásadního omezení objevních dat v hybridních režimech.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení kapacity cílených assay: menší potřeba širokých bezpečnostních oken nebo těžce značených standardů, tedy větší počet cílených analyzovaných peptidů za jednotku času.
• Možnost nasazení v kohortních studiích a klinických aplikacích, kde je konsistence mezi stovkami až tisíci injekcí kritická.
• Flexibilita: aRT zajišťuje odolnost proti běžnému opotřebení kolony, výměnám součástí LC systému a změnám matrice vzorků.
• Hybridní DIA workflow dává laboratořím možnost současně získávat kvalitní objevní data a přitom cíleně sledovat důležité peptidy, například pro validaci biomarkerů, sledování nízko abundantních cílových peptidek nebo PTM bez nutnosti separátního obohacení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce adaptivních RT algoritmů v kombinaci s rychlými analyzátory povede k dalšímu zvyšování propustnosti a počtu sledovaných targetů ve velkých studiích.
• Optimalizace hybridních režimů pro citlivější sledování nízko abundantních signálů a posttranslačních modifikací v neobohacených vzorcích.
• Integrace adaptivních strategií s cloudovými nebo on-instrument databázovými přístupy a pokročilou kontrolou kvality pro dlouhodobé studie a multi-laboratorní kooperace.
• Vývoj standardizovaných referenčních materiálů a automatizovaných pracovních postupů pro zjednodušení nasazení do regulovaných prostředí (klinická a GLP laboratorní prostředí).

Závěr

Adaptivní korekce retenčního času na Orbitrap Astral Zoom MS výrazně zvyšuje spolehlivost a kapacitu cílených proteomických workflow při vysoké propustnosti. aRT umožňuje použít velmi úzká plánovací okna, dosahuje vysoké úspěšnosti zachycení cílových peptidů i v rozsáhlých sadách (až tisíce targetů) a lze ji úspěšně kombinovat s úzkopásmovým DIA pro hybridní získávání dat. To otevírá praktické možnosti pro rozsáhlé kohortní studie a rychlé cílené aplikace bez zásadního kompromisu v objevní části dat.

Reference

1. Remes PM, et al. Highly Multiplex Targeted Proteomics Enabled by Real-Time Chromatographic Alignment. Analytical Chemistry. 2020.